家族性開角型青光眼致病基因篩查與功能研究.pdf

1、目的青光眼是以進(jìn)行性視神經(jīng)變性和視野缺損為特征的一類綜合癥，位列全球第二位不可逆性致盲眼病。隨著我國(guó)人口結(jié)構(gòu)老齡化，開角型青光眼的發(fā)病率逐漸增加，嚴(yán)重威脅患者視功能，對(duì)個(gè)人和社會(huì)均造成巨大損失。原發(fā)性開角型青光眼發(fā)病機(jī)制尚未闡明。目前普遍觀點(diǎn)認(rèn)為原發(fā)性開角型青光眼為遺傳異質(zhì)性疾病，遺傳因素在POAG的發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵作用。迄今為止已定位了6個(gè)POAG相關(guān)染色體位點(diǎn)，鑒定出兩個(gè)開角型青光眼相關(guān)致病基因：TIGR/MYOC(trabecl

2、uarmeshwork-inducibleglucocorticoidresponse)基因和OPTN基因(optineurin)。1999年葛堅(jiān)教授課題組首先報(bào)道了一個(gè)典型、完整的原發(fā)性開角型青光眼大家系(GZ.1家系)。該家系具有家族聚集性、地域封閉性、遺傳穩(wěn)定性、臨床特征性等特點(diǎn)，具備青光眼分子遺傳學(xué)研究的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。 本研究應(yīng)用全基因組掃描和基因測(cè)序法證實(shí)TIGR/MYOC基因?yàn)榧易逍蚤_角型青光眼家系的致病基因，該家系中T

3、IGR/MYOC基因存在Pro370Leu和Arg169Gly兩種突變型，進(jìn)一步本研究利用體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，對(duì)Pro370Leu和Arg169Gly突變型TIGR/MYOC基因進(jìn)行體內(nèi)外功能研究，試圖解讀TIGR/MYOC基因的致病機(jī)制，旨在通過揭示這一典型青光眼家系獨(dú)特表型背后的遺傳本質(zhì)以及疾病發(fā)生、發(fā)展的過程，為原發(fā)性開角型青光眼發(fā)病機(jī)制的研究提供線索。 方法1.利用全基因組掃描、單倍體型分析以及基因測(cè)序方法對(duì)GZ.1家族

4、性開角型青光眼家系的致病基因進(jìn)行定位篩查； 2.正常人眼小梁細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定：從角膜移植后剩余組織取材，利用組織塊培養(yǎng)法，進(jìn)行小梁細(xì)胞體外培養(yǎng)，并利用光鏡、電鏡、細(xì)胞免疫組織化學(xué)法鑒定小梁細(xì)胞； 3.突變型TIGR/MYOC基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建：在野生型TIGR/MYOC基因真核表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，利用定點(diǎn)突變技術(shù)，分別構(gòu)建Arg169Gly和Pro370Leu突變型TIGR/MYOC基因真核表達(dá)載體； 4.

5、野生型以及突變型TIGR/MYOC基因真核表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)染小梁細(xì)胞：利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小梁細(xì)胞，分別檢測(cè)野生型以及突變型TIGR/MYOC蛋白在細(xì)胞內(nèi)外的表達(dá)量及其亞細(xì)胞器定位，細(xì)胞骨架蛋白-肌動(dòng)蛋白和紐蛋白的形態(tài)與分布，小梁細(xì)胞遷移能力，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶-PDI和GRP78、基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)；并利用Hochest染色以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況； 5.野生型以及突變型TIGR/MYOC基因真核表達(dá)載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染：利用陽(yáng)

6、離子聚合物(PEI)介導(dǎo)野生型以及突變型TIGR/MYOC基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染小梁網(wǎng)，分別于轉(zhuǎn)染后1d，3d，7d，14d進(jìn)行小梁組織病理學(xué)切片、免疫組織化學(xué)、透射電子顯微鏡檢測(cè)小梁組織的結(jié)構(gòu)改變。 結(jié)果1.經(jīng)全基因組掃描、單倍體型分析以及基因測(cè)序方法證實(shí)，GZ.1家族性開角型青光眼家系的致病基因定位于1號(hào)染色體的TIGR/MYOC基因，TIGR/MYOC基因存在Pro370Leu和Arg169Gly兩種突變型； 2.體外成功培

7、養(yǎng)正常人眼小梁細(xì)胞，并獲得Pro370Leu和Arg169Gly突變型TIGR/MYOC基因真核表達(dá)載體； 3.經(jīng)Westernblot分析檢測(cè)證實(shí)，培養(yǎng)上清液中突變型TIGR/MYOC蛋白的細(xì)胞外分泌較野生型明顯減少； 4.熒光免疫組化證實(shí)野生型TIGR/MYOC蛋白在小梁細(xì)胞內(nèi)呈點(diǎn)狀、彌漫、散在分布；Argl69Gly突變型TIGR/MYOC蛋白的分布向核周集中，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度重疊;而Pro370Leu突變型TIGR/

8、MYOC蛋白是以大小不等、分布不均的積聚體形式存在于胞漿內(nèi)； 6.RT-PCR以及westernblot分析結(jié)果顯示Arg169Gly突變型轉(zhuǎn)染組GRP78和PDI表達(dá)較對(duì)照組、野生型TIGR/MYOC基因轉(zhuǎn)染組輕度升高； 7.野生型以及突變型TIGR/MYOC基因?qū)π×杭?xì)胞功能的影響 (1)突變型TIGR/MYOC基因轉(zhuǎn)染小梁細(xì)胞中微絲束粗大并向胞膜處邊集，紐蛋白在核周的分布明顯減少，而在胞膜處的分布則變得不連

9、續(xù)、不規(guī)則、呈散在點(diǎn)狀； (2)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示突變TIGR/MYOC基因轉(zhuǎn)染小梁細(xì)胞遷移率較野生型以及正常對(duì)照輕度下降，與細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白絲再分布及周邊部集聚相一致； (3)RT-PCR、western印跡雜交分析證實(shí)，Arg169Gly突變型TIGR基因轉(zhuǎn)染組MMP-2的表達(dá)明顯下降，但MMP-9的表達(dá)無明顯改變。 (4)Hotchest染色以及流式細(xì)胞檢測(cè)各組間凋亡細(xì)胞百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 8.野生型

10、以及突變型TIGR/MYOC基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染小梁網(wǎng)，小梁組織病理學(xué)切片未觀察到明顯異常，但透射電鏡觀察小梁組織發(fā)現(xiàn)小梁細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、線粒體水腫、細(xì)胞凋亡、脫落。 結(jié)論1.GZ.1家族性開角型青光眼家系的致病基因?yàn)門IGR/MYOC基因; 2.TIGR/MYOC基因Pro370Leu突變?yōu)镚Z.1家族性開角型青光眼家系的致病性突變，可以作為一種檢測(cè)家系成員青光眼發(fā)病危險(xiǎn)性的早期基因診斷手段； 3.Pro370Le

11、u和Arg169Gly突變型TIGR/MYOC蛋白的致病機(jī)制不同：發(fā)生于TIGR/MYOC蛋白N端的Arg169Gly突變型TIGR/MYOC蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積聚，并可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)；而發(fā)生于TIGR/MYOC蛋白C端的Pro370Leu突變型TIGR/MYOC蛋白在細(xì)胞胞漿內(nèi)以難以降解的積聚體形式存在； 4.GZ.1家族性開角型青光眼家系可能的發(fā)病機(jī)理為：Pro370Leu和Arg169Gly突變型TIGR/MYOC蛋白一級(jí)

12、結(jié)構(gòu)的改變，使得蛋白質(zhì)α-螺旋或β-折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成不能正確完成，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯(cuò)誤折疊、功能構(gòu)象發(fā)生嚴(yán)重錯(cuò)誤，蛋白質(zhì)無法正常分泌，在細(xì)胞內(nèi)積聚，對(duì)小梁細(xì)胞造成毒性作用，小梁細(xì)胞功能異常，最終導(dǎo)致了GZ.1家系POAG的發(fā)生； 5.Pro370Leu可能屬于一種較為常見、古老的突變，與該家系早期發(fā)生、病情嚴(yán)重的臨床表型高度相關(guān)，對(duì)于GZ.1家系青光眼的發(fā)生起到關(guān)鍵的作用；6.Arg169Gly突變作為一種罕見變異為