PCR-ACRS法篩查成年漢族人CYP21基因P459H的突變位點.pdf

1、目的： 先天性腎上腺皮質增生癥(CAH)是一種較常見的常染色體隱性遺傳病，由21-羥化酶缺陷引起者約占90％～95％。此酶由21-羥化酶基因編碼，缺乏可引起皮質醇合成不足以及前體底物堆積。主要臨床表現是性發(fā)育畸形：女性患者外生殖器男性化，男性患者出現假性性早熟。21-羥化酶基因位于人類6號染色體短臂6p21.3組織相容性抗原Ⅲ(HLAⅢ)基因區(qū)，由無活性的假基因(CYP21P)和有活性的真基因(CYP21)串聯排列組成。大約95

2、％的CYP21基因突變是由于真假基因相互作用引起，其余5％的患者等位基因含有特別的突變。迄今已發(fā)現80余種CYP21基因突變導致21-羥化酶缺陷癥(21-OHD)，目前國內僅是對較常見的9個突變進行檢測，尚未見新的基因突變報道。我們在前期工作中收集了3個21-OHD家系，采用PCR擴增產物直接測序的方法，對患者及其家系進行基因突變分析，發(fā)現了一個國內外尚未見報道的新突變P459H(即外顯子10第459位密碼子CCC突變?yōu)镃AC，導致編碼

3、蛋白質上相應的脯氨酸變?yōu)榻M氨酸)。為進一步驗證該基因突變確實屬于點突變，而非基因多態(tài)，本研究采用PCR結合擴增引進限制性內切酶酶切位點(PCR-ACRS)的方法對100名正常成年漢族人該位點進行分析。 方法： 1例CAH患者，社會性別為女性，通過臨床表現，皮質醇、促腎上腺皮質激素(ACTH)、17-羥孕酮(17-OHD)、睪酮(T)等激素測定和影像學檢查確立診斷。100例正常成年漢族人從山東大學齊魯醫(yī)院健康查體中心隨機選

4、取，平均年齡(28±5)歲，其中男性52例，女性48例。相互之間無親緣關系，排除CAH家族史。 取受檢者外周靜脈血2ml，EDTA-K2抗凝。抽提基因組DNA，根據真假基因序列的差別，設計特異性引物擴增CYP21基因3～10外顯子，Pst Ⅰ限制性內切酶消化驗證PCR產物為特異性擴增。應用PCR-ACRS方法擴增所有樣本的首次PCR產物，Fsp Ⅰ限制性內切酶酶切后用10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)篩查P459H變異的

5、發(fā)生率。 結果： 1．首次PCR擴增產物即CYP21基因第3～10外顯子用Pst Ⅰ限制性內切酶酶切，由于真假基因上Pst Ⅰ限制性內切酶酶切位點數目不同，造成酶切片段大小不同，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳，可以鑒別真假基因，經Pst Ⅰ限制性內切酶證實所擴增的均為真基因序列。 2．患者CYP21基因第10外顯子攜帶P459H變異(CCC→CAC)，100例正常成年漢族人CYP21基因第10外顯子密碼子459均為CC