腺相關(guān)病毒在小鼠乙肝模型的研究應(yīng)用.pdf

1、乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒(Hepatitis Bvirus，HBV)引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹鞑⒖梢鸲嗥鞴俟δ苷系K的傳染病。HBV感染的動物模型為更好的進(jìn)行HBV相關(guān)研究提供有力工具。腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus，AAV)因其宿主廣泛、安全性強(qiáng)、介導(dǎo)外源基因持續(xù)表達(dá)等優(yōu)點，作為病毒載體受到廣泛關(guān)注。目前，一種攜帶1.3拷貝HBV基因組的8型腺相關(guān)病毒(rAAV8-1.3HBV)被成功用于建立持續(xù)感染的HB

2、V小鼠模型。本課題以rAAV8-1.3HBV為參照，評價攜帶1.3拷貝HBV基因組的1型、2型、5型、9型腺相關(guān)病毒(rAAV1-1.3HBV、rAAV2-1.3HBV、rAAV5-1.3HBV、rAAV9-1.3HBV)建立乙肝小鼠模型的效果。
　　實驗主要包括以下內(nèi)容:(1)準(zhǔn)備所需的5種血清型重組腺相關(guān)病毒，分別為攜帶1.3拷貝HBV基因組的1型、2型、5型、8型、9型腺相關(guān)病毒，采用定量PCR法測定5種病毒滴度。(2)細(xì)胞

3、實驗:將含腺相關(guān)病毒倒轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列元件與包含1.3個拷貝HBV基因組的HBV表達(dá)質(zhì)粒(pAAV-1.3HBV)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞（肝癌細(xì)胞），5種重組病毒感染Huh7細(xì)胞，檢測細(xì)胞上清HBeAg和HBsAg表達(dá)。(3)小鼠實驗:5種重組病毒通過尾靜脈注射法按照劑量1×1011vg/只注射至C57BL/6J小鼠體內(nèi)，并在8周時間內(nèi)檢測HBV相關(guān)指標(biāo)來評價小鼠模型:連續(xù)測定各組小鼠血清中HBeAg和HBsAg表達(dá)情況; H

4、BV DNA（血清和肝臟）通過定量PCR法測定;HBcAg（肝臟）使用免疫組化法檢測;小鼠肝臟病理情況應(yīng)用HE染色測定。
　　實驗結(jié)果如下:(1)rAAV1-1.3HBV、rAAV2-1.3HBV、rAAV5-1.3HBV、rAAV8-1.3HBV、rAAV9-1.3HBV滴度分別為3.0×1011、3.4×1011、9.3×1011、7.2×1011、4.26×1011vg·mL-1。(2) pAAV-1.3HBV組細(xì)胞上清中能

5、檢測到HBeAg和HBsAg表達(dá)，病毒組細(xì)胞上清均無表達(dá)。(3) HBV相關(guān)檢測指標(biāo)表明，連續(xù)8周時間內(nèi)，5組注射病毒的小鼠血清中都能定量測定到HBeAg、 HBsAg和HBV DNA;5組小鼠的肝臟也可檢測出HBVDNA，且HBV DNA拷貝數(shù)肝臟明顯高于血清;同時5組小鼠在8周后HBeAg、HBsAg、HBV DNA三個表達(dá)水平的排序相同，均為AAV8＞AAV9＞AAV1＞AAV5＞AAV2;5組小鼠肝細(xì)胞中均能檢測到HBcAg高強(qiáng)

6、度表達(dá)和一定程度的病變。
　　通過以上研究表明利用AAV載體建立乙肝模型，在體內(nèi)和體外存在差異，rAAV1-1.3HBV、rAAV2-1.3HBV、rAAV5-1.3HBV、rAAV8-1.3HBV、rAAV9-1.3HBV在體內(nèi)均可建立持續(xù)感染的HBV小鼠模型，細(xì)胞實驗則不能建立HBV模型。同時，不同血清型AAV形成的模型效果存在一定差異，具有嗜肝性的AAV8載體建模效果最好，其效果依次AAV8＞AAV9＞AAV1＞AAV5＞A