胰高糖素樣肽-1對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶的影響及機(jī)制的研究.pdf

1、以動(dòng)脈粥樣硬化為基礎(chǔ)的大血管并發(fā)癥是2型糖尿病的主要并發(fā)癥,是患者致殘、致死的主要原因。其防治是內(nèi)分泌、心血管及神經(jīng)等相關(guān)學(xué)科關(guān)注的重點(diǎn)課題。
　　 內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞,在其催化下合成和釋放一氧化氮(NO)是血管內(nèi)皮細(xì)胞最重要的生理功能之一。作為內(nèi)皮源性的舒血管因子,NO還具有抗炎、抗氧化、抗凝、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等作用,e

2、NOS催化合成和釋放NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞抵御多種致動(dòng)脈粥樣硬化性損傷的自我保護(hù)功能之一。目前的研究發(fā)現(xiàn),2型糖尿病患者體內(nèi)的多種病理變化可通過(guò)引起eNOS活性及表達(dá)異常,使NO合成障礙,說(shuō)明eNOS/NO功能障礙可能是2型糖尿病患者發(fā)生內(nèi)皮功能異常進(jìn)而形成動(dòng)脈粥樣硬化的核心機(jī)制之一。
　　 胰高糖素樣肽-1(glucagons like peptide-1,GLP-1)是一種肽類激素,在維持機(jī)體糖代謝穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。2型糖尿病

3、患者存在GLP-1分泌缺陷及作用下降,這已經(jīng)成為公認(rèn)的2型糖尿病糖代謝紊亂的機(jī)制之一,進(jìn)而以GLP-1為核心的降糖藥物被陸續(xù)研發(fā)并成功的應(yīng)用于糖尿病的治療。近期的研究發(fā)現(xiàn)GLP-1可引起內(nèi)皮依賴性的血管舒張;該作用可被eNOS的抑制劑阻斷;輸注GLP-1可使小鼠冠脈血流中NO含量增加。這些研究均提示,GLP-1很可能具有上調(diào)eNOS/NO的生理作用。研究GLP-1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS/NO的影響,可以在一定程度上闡明GLP-1發(fā)揮上述血管

4、內(nèi)皮效應(yīng)的分子機(jī)制。更重要的是,由于eNOS/NO是內(nèi)皮細(xì)胞抗動(dòng)脈粥樣硬化的主要機(jī)制之一,該研究將提示,GLP-1作為一種生理性激素,可能通過(guò)對(duì)eNOS/NO的調(diào)控發(fā)揮內(nèi)源性的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用,而存在于2型糖尿病患者中的GLP-1分泌缺陷及作用下降,很有可能成為該類患者合并動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一,以GLP-1為核心的治療策略也可能在有效降糖的同時(shí)具有直接的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。
　　 已知,體內(nèi)存在特異性的GLP-1受體(GLP

5、-1 rcceptor,GLP-1R),GLP-1對(duì)糖代謝的調(diào)控主要通過(guò)存在于胰島、胃腸道和腦組織的GLP-1R介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)。近期的研究發(fā)現(xiàn)在血管內(nèi)皮細(xì)胞也有該受體的表達(dá),提示GLP-1R可能參與介導(dǎo)GLP-1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控。值得關(guān)注的是,隨著對(duì)GLP-1生理作用研究的不斷深入,特別是在近期對(duì)其心血管系統(tǒng)作用的研究中,有一些證據(jù)表明,體內(nèi)可能還存在著一種目前尚未知的不依賴于GLP-1R但與GLP-1(9-36)相關(guān)的信號(hào)通路

6、介導(dǎo)GLP-1的某些生物效應(yīng)。GLP-1(9-36)是二肽基肽酶Ⅳ(DipeptidylpeptidaseⅣ,DPPⅣ)降解GLP-1形成的代謝產(chǎn)物,因不具有GLP-1R親和力,既往被認(rèn)為無(wú)生物活性。研究發(fā)現(xiàn),在不表達(dá)GLP-1R的變異小鼠,GLP-1仍可舒張其腸系膜動(dòng)脈,用GLP-1(9-36)可以引起與GLP-1相似甚至更強(qiáng)的舒血管作用,而單純的GLP-1R激動(dòng)劑卻無(wú)效;以DPPⅣ抑制劑阻斷GLP-1向GLP-1(9-36)的轉(zhuǎn)化,

7、可使GLP-1的作用減弱。上述研究提示,在GLP-1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控中,可能存在兩種信號(hào)通路,即GLP-1R依賴性和GLP-1(9-36)相關(guān)的非GLP-1R依賴性通路。對(duì)于可能存在雙重信號(hào)傳導(dǎo)通路這一假設(shè)進(jìn)行證實(shí)并對(duì)相關(guān)問(wèn)題開(kāi)展深入的研究,不僅有助于揭示GLP-1發(fā)揮內(nèi)皮調(diào)控作用的分子機(jī)制,更重要的是,它提示要全面改善糖尿病患者與GLP-1水平下降相關(guān)的病理生理變化,以GLP-1為核心的治療策略須在重視提高GLP-1R激動(dòng)作用的同

8、時(shí)兼顧如何改善非GLP-1R依賴性信號(hào)通路的作用,特別是其心血管系統(tǒng)的作用。
　　 目的：
　　 綜上所述,本實(shí)驗(yàn)觀察GLP-1在正常及高糖環(huán)境下對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)NO釋放、eNOS活性及磷酸化水平及其總蛋白和mRNA水平的影響,了解GLP-1對(duì)eNOS/NO是否具有上調(diào)作用;并進(jìn)一步觀察GLP-1R及GLP-1(9-

9、36)在其中所起的作用,以明確在GLP-1對(duì)eNOS的調(diào)控中是否存在雙重信號(hào)通路。本課題旨在通過(guò)上述研究,為進(jìn)一步探討2型糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制提供新的思路,為以GLP-1為核心,研發(fā)兼具降糖及抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的糖尿病治療藥物提供一點(diǎn)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、HUVECs培養(yǎng),在正常葡萄糖濃度(5.5mmol/L)條件下,以含不同濃度GLP-=1的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞,在不同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞及培養(yǎng)液,

10、檢測(cè)HUVECs的NO釋放、eNOS活性、eNOS1177位絲氨酸磷酸化水平(p-eNOS(ser-1177))、總蛋白和mRNA水平,以了解GLP-1對(duì)eNOS/NO的調(diào)控作用;在高糖(16.8mmol/L)條件下,以含GLP-1的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞,在特定時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞及培養(yǎng)液,檢測(cè)上述指標(biāo),以了解高糖環(huán)境是否會(huì)影響GLP-1對(duì)eNOS/NO的調(diào)控;以含相同濃度GLP-1、exenafide(一種GLP-1R激動(dòng)劑)、GLP-1(9-3

11、6)的培養(yǎng)液分別孵育細(xì)胞,在特定時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞及培養(yǎng)液,檢測(cè)上述指標(biāo),再以exendin(9-39)(GLP-1R拮抗劑)和/或sitagliptin(DPPⅣ抑制劑)與GLP-1共同孵育細(xì)胞,在特定時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞及培養(yǎng)液,檢測(cè)上述指標(biāo),以了解GLP-1R和GLP-1(9-36)是否均參與GLP-1對(duì)eNOS/NO的調(diào)控。
　　 2、采用硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量,確定HUVECs的NO釋放量。
　　 3、采用

12、NOS檢測(cè)試劑盒(熒光法),應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)HUVECs內(nèi)eNOS活性。
　　 4、采用Western blot法檢測(cè)HUVECs內(nèi)p-eNOS(ser-1177)、總eNOS蛋白表達(dá)。
　　 5、應(yīng)用real time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)eNOS mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、在正常葡萄糖geN(5.5 mmol/L)條件下,50-5000pM的GLP-1可使HUVECs的NO釋放增加(

13、P＜0.05),eNOS活性提高(P＜0.05),且有量效關(guān)系;500-5000pM的GLP-1可提高HUVECs內(nèi)p-eNOS(Ser-1177)水平(P＜0.05),5000pM的GLP-1可提高HUVECs內(nèi)總eNOS蛋白水平(P＜0.05),但對(duì)eNOS mRNA水平無(wú)影響(P＞0.05)。
　　 2、在高糖(16.8mmol/L)條件下,GLP-1仍可增加HUVECs的NO釋放(P＜0.05),提高eNOS活性(P＜0

14、.05),提高HUVECs內(nèi)p-eNOS(ser-1177)水平(P＜0.05)、總eNOS蛋白水平(P＜0.05),而且還可提高HUVECs內(nèi)eNOS mRNA水平(P＜0.05)。
　　 3、與GLP-1相似,5000pM的exenatide或GLP-1(9-36)均可提高HUVECs的NO釋放、eNOS活性、p-eNOS(ser-1177)水平、總eNOS蛋白水平(P＜0.05)。在高糖條件下,exenatide可提高eN

15、OS mRNA水平(P＜0.05),但GLP-1(9-36)對(duì)其水平無(wú)影響(P＞0.05)。
　　 4、GLP-1R拮抗劑或DPPⅣ抑制劑或兩者同時(shí)作用,均只能部分阻斷GLP-1對(duì)HUVECs的NO釋放、eNOS活性、p-eNOS(ser-1177)水平、總eNOS蛋白水平的影響(P＜0.05),GLP-1R拮抗劑的存在可完全阻斷高糖條件下GLP-1對(duì)eNOSmRNA水平的影響(P＜0.01),DPPⅣ抑制劑對(duì)其無(wú)影響(P＞0.

16、05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、GLP-1對(duì)體外培養(yǎng)的HUVECs具有上調(diào)其eNOS活性及表達(dá),進(jìn)而增加其NO釋放的作用,提示作為參與血糖調(diào)控的生理性激素,GLP-1可能在維持血管內(nèi)皮正常功能中發(fā)揮作用。2型糖尿病患者存在的GLP-1分泌缺陷可能是其并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。
　　 2、高糖環(huán)境不影響GLP-1對(duì)HUVECs的eNOS/NO的上調(diào)作用,提示以GLP-1為核心的降糖藥物可對(duì)糖尿病患者發(fā)揮改善血管