葛根素預(yù)處理上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶的蛋白表達(dá)保護(hù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷.pdf

1、目的：觀察葛根素（puerarin,PUE）預(yù)處理對內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）蛋白表達(dá)及磷酸化的影響，以及可能涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，探討其減輕人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）缺氧（Hypoxia,H）/復(fù)氧（Reoxygenation,R）損傷的作用機(jī)制。
　　方法：SABC法進(jìn)行HU

2、VECs細(xì)胞鑒定后，采用缺氧2小時、4小時、8小時培養(yǎng)后恢復(fù)常氧條件培養(yǎng)4小時的方法造成HUVECs缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷。將HUVECs隨機(jī)分為正常對照（Control）組、H/R組、單純PUE組和PUE預(yù)處理+H/R組（1.0×10-3mol/L PUE預(yù)處理24h后進(jìn)行H/R）。此外，取缺氧4小時/復(fù)氧4小時(H4/R4）組，在PUE預(yù)處理前分別使用ERK1/2蛋白激酶抑制劑U0126（1.0×10-5mol/L）、PI3K/A

3、kt蛋白激酶抑制劑 LY294002（5.0×10-5mol/L），處理細(xì)胞1h，再進(jìn)行H/R，并設(shè)立抑制劑單純用藥和溶媒對照組。采用Western blot方法檢測eNOS蛋白的表達(dá)、eNOS Ser117、Ser633、Thr495磷酸化水平，Akt蛋白和Akt Thr308、Ser473位點(diǎn)的磷酸化水平，ERK1/2蛋白和ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化水平?；瘜W(xué)比色法檢測結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（constitutive

4、 NOS，cNOS）的活性。TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：
　?、排cControl組相比，H/R組的eNOS蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05），eNOS Ser1177和Ser633磷酸化水平隨eNOS蛋白表達(dá)降低相應(yīng)降低；Akt Thr308和Ser473磷酸化水平，以及ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化水平均明顯降低（P<0.05），cNOS的活力下降（P<0.05）；eNOS Thr495、Akt蛋白

5、、ERK1/2蛋白各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　⑵ PUE預(yù)處理后，與同時間點(diǎn)H/R組相比，eNOS蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05），eNOS Ser1177、Ser633磷酸化水平隨eNOS蛋白表達(dá)升高相應(yīng)升高；Akt Thr308、Ser473及ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化水平均顯著升高（P<0.05），cNOS活力增加（P<0.05），各組間eNOS Thr495、Akt蛋白、ERK1/2蛋白差異無統(tǒng)計學(xué)意

6、義。
　?、?U0126處理后，與PUE+H4/R4組和 PUE組比較，U0126+PUE+H4/R4組、U0126+PUE組eNOS蛋白表達(dá)和ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化水平下降（P<0.05）。
　　⑷ LY294002處理后，與PUE+H4/R4組和PUE組比較，LY294002+PUE+H4/R4組、LY294002+PUE組eNOS蛋白表達(dá)和Akt Thr308、Ser473磷酸化水平降低（P<0

7、.05）。
　?、?H/R損傷后HUVECs凋亡指數(shù)顯著升高（P<0.01），PUE預(yù)處理后的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　?、?H/R損傷可引起HUVECs中eNOS蛋白表達(dá)降低，酶活性降低，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而使內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷。
　?、?PUE預(yù)處理可使eNOS蛋白表達(dá)增加，酶活性增加，細(xì)胞凋亡減少，發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)效應(yīng)。
　?、?H/R后eNOS蛋白表達(dá)的降低可能與ERK1/2、