基于iTRAQ技術(shù)對(duì)玉米K305ms育性差異表達(dá)蛋白的分析.pdf

1、玉米是最早利用雜種優(yōu)勢(shì)的作物，利用雄性不育系生產(chǎn)雜交種子，可以提高種子純度和降低生產(chǎn)成本。但是，目前對(duì)玉米細(xì)胞核雄性不育的敗育機(jī)制還不十分清楚，從而限制了其生產(chǎn)應(yīng)用。本研究以玉米K305ms為材料，利用iTRAQ技術(shù)構(gòu)建花藥發(fā)育3個(gè)不同時(shí)期的可育和不育花藥蛋白質(zhì)表達(dá)譜，并對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行比較分析。通過(guò)GO、COG和Pathway注釋和富集分析，挖掘與育性相關(guān)的功能蛋白和關(guān)鍵代謝途徑。結(jié)合蛋白免疫技術(shù)、熒光定量技術(shù)和氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)驗(yàn)

2、證，探討K305ms的敗育機(jī)制，為進(jìn)一步研究利用奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　1.利用iTRAQ技術(shù)共鑒定到肽段27607個(gè)，蛋白質(zhì)6606個(gè)。GO分析表明這些蛋白主要分布于細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)器官上，以結(jié)合活性和催化活性蛋白為主，主要參與細(xì)胞的代謝過(guò)程和細(xì)胞過(guò)程;COG功能分類顯示除通用功能外，大多數(shù)為翻譯后修飾、分子伴侶、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成蛋白;pathway代謝途徑注釋發(fā)現(xiàn)304條代謝通路，主要集中在碳水化合物代

3、謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝、細(xì)胞物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸與信號(hào)傳遞及次生代謝物代謝途徑。聚類分析顯示，在花藥發(fā)育早期和后期，不育和可育花藥蛋白表達(dá)模式相似，而中期表達(dá)模式則不同，暗示中期（減數(shù)分裂期）可能是敗育關(guān)鍵時(shí)期。
　　2.比較篩選結(jié)果，在可育和不育花藥3個(gè)發(fā)育時(shí)期分別鑒定出175、215和426個(gè)，共721個(gè)顯著的差異表達(dá)蛋白。這些蛋白在早期可育比不育上調(diào)表達(dá)23個(gè)，下調(diào)表達(dá)24個(gè);中期上調(diào)16個(gè)，下調(diào)49個(gè);后期上調(diào)59個(gè)，下調(diào)1

4、2個(gè)。 GO富集分析表明，主要包括轉(zhuǎn)運(yùn)活性和電子載體活性蛋白等，參與細(xì)胞的代謝過(guò)程、生長(zhǎng)發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。COG功能分類顯示翻譯后修飾、分子伴侶和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換差異表達(dá)蛋白居多。pathway富集分析表明，差異表達(dá)蛋白涉及198條代謝途徑，根據(jù)相關(guān)蛋白富集和差異表達(dá)的持續(xù)性，推測(cè)碳水化合物和能量代謝、脂肪酸代謝、脂肪酸鏈延長(zhǎng)等途徑可能是導(dǎo)致敗育的通路之一。
　　3.篩選出Hsp70、ADGP和ATPβ三個(gè)蛋白作為一抗，以β-Actin為

5、內(nèi)參抗體采用Western blot免疫表達(dá)分析結(jié)果顯示，Hsp70在花藥發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量差異不顯著，ADGP在花藥發(fā)育后期表達(dá)量差異顯著，ATPβ在花藥發(fā)育中期表達(dá)量差異顯著，與iTRAQ結(jié)果趨勢(shì)一致。ATPβ在能量代謝中具有重要的作用，在發(fā)育中期不育花藥幾乎是痕量。不育花藥發(fā)育中期ATPβ含量低于可育花藥，可能導(dǎo)致中期能量供應(yīng)不足，影響正常減數(shù)分裂。
　　4.選取7個(gè)相關(guān)差異表達(dá)蛋白對(duì)應(yīng)的基因設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)qRT-PCR反

6、應(yīng)檢測(cè)3個(gè)時(shí)期可育和不育花藥的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄本水平與其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平基本一致。代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要功能是在脂肪酸生物合成和脂質(zhì)代謝途徑中發(fā)揮重要作用，通過(guò)影響脂肪酸鏈延長(zhǎng)和降解影響脂類物質(zhì)合成。脂類物質(zhì)的減少可能會(huì)造成外壁的降解，花粉粒無(wú)法形成導(dǎo)致敗育。
　　5.通過(guò)氣相-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)，測(cè)定3個(gè)時(shí)期可育和不育花藥的蠟質(zhì)和角質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)3個(gè)時(shí)期不育花藥蠟質(zhì)含量略低于可育花藥，差異均不顯著;角質(zhì)含量前

7、期和后期不育花藥低于可育花藥，而中期可育花藥低于不育花藥，差異均達(dá)極顯著水平。部分長(zhǎng)鏈角質(zhì)單體的含量不育花藥極顯著低于可育花藥。進(jìn)一步驗(yàn)證了脂肪酸鏈延長(zhǎng)和脂質(zhì)代謝異?？赡軐?dǎo)致玉米雄性不育。
　　6.推測(cè)玉米K305ms敗育原因可能是由于前期和中期碳水化合物和能量供應(yīng)不足，導(dǎo)致花藥發(fā)育早期相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及核糖體合成受到抑制，造成花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂異常;中后期相關(guān)代謝通路受阻，尤其是脂肪酸合成和脂質(zhì)代謝中脂肪酸鏈的延長(zhǎng)不能正常進(jìn)行