iTRAQ聯(lián)合質(zhì)譜技術篩選慢性氟中毒大鼠骨組織差異蛋白及生物信息學分析.pdf

1、目的：采用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學技術，比較不同劑量氟中毒大鼠及對照組大鼠骨組織的蛋白表達差異，獲得氟中毒大鼠骨組織中差異表達蛋白。通過生物信息學分析鑒定這些差異表達蛋白，并分析蛋白相互作用及可能參與的信號通路，為揭示氟骨癥發(fā)生的分子機制提供科學依據(jù)。
　　方法:1.慢性氟中毒大鼠模型的建立與驗證：48只健康SD大鼠隨機分為4組，對照組飲用自來水,低氟組、中氟組、高氟組分別飲用含50、150、250 mg/L氟化鈉的自來水。飼養(yǎng)6

2、個月后，檢測氟斑牙發(fā)生率，氟離子選擇電極法檢測各組大鼠尿氟、骨氟、牙氟、血清氟含量；取大鼠股骨干骺端進行石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色、光鏡觀察，骨組織形態(tài)學計量染氟大鼠骨組織形態(tài)學改變；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠血清骨代謝標志物含量。2.采用iTRAQ聯(lián)合質(zhì)譜技術篩選差異蛋白：提取四組大鼠骨勻漿蛋白酶解為肽段，以iTRAQ試劑標記，經(jīng)過強陽離子SCX交換，反相液相色譜分離，質(zhì)譜鑒定和蛋白檢索后得到差異蛋白；對差異蛋白進行GO

3、分析、KEGG pathway分析、STRING分析等生物信息學方法進行分析，尋找差異蛋白顯著相關的生物學功能，參與的代謝通路和信號轉(zhuǎn)導途徑，分析蛋白-蛋白互相作用網(wǎng)絡；篩選出關鍵蛋白MMP8（基質(zhì)金屬蛋白酶）、CRT（鈣網(wǎng)織蛋白）。3.免疫組織化學染色法驗證MMP8、CRT的表達：取大鼠骨組織石蠟切片，免疫組化超敏二步法染色觀察MMP8、CRT在股骨組織中的表達，IPP軟件測定平均光密度驗證蛋白表達水平。
　　結果：1.慢性氟中

4、毒大鼠模型建立及驗證:（1）氟斑牙發(fā)生情況與氟負荷量的變化：各染氟組大鼠氟斑牙檢出率、尿氟、骨氟和血清氟含量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而且隨染氟劑量增高，氟斑牙嚴重程度、尿氟、骨氟、牙氟和血氟呈上升趨勢。（2）大鼠股骨組織形態(tài)計量學結果：中、高氟組大鼠的骨皮質(zhì)厚度均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；低氟組骨小梁平均面積小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；低中高氟組成骨細胞數(shù)均低于對照組，差異有

5、統(tǒng)計學意義（P<0.05）。BGP、BALP、PⅠNP檢測結果：低氟組與對照組比較呈下降趨勢，BALP有顯著差異（P <0.01)，中、高氟組BGP、BALP含量小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；CTX-Ⅰ、TRACP-5b檢測結果：低中、高氟組TRACP-5b含量均小于對照組，中、高氟組CTX-Ⅰ小于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05)。2.鑒定到顯著性差異蛋白質(zhì)63個：（1）相對于正常組，低氟組差異蛋白共

6、13個，中氟組差異蛋白共35個，高氟組差異蛋白共33個；（2）差異蛋白參與的生物學過程有37種、細胞組分有39種、分子功能有40種；（3）參與的相關信號通路15條。（4）差異蛋白質(zhì)內(nèi)部構建了基因網(wǎng)絡關系圖，51個蛋白質(zhì)的基因都有直接或間接的聯(lián)系。3.免疫組化驗證MMP8與CRT表達：（1）低氟組、中氟組、高氟組的骨細胞MMP-8的IOD值均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；低氟組成骨細胞MMP-8的IOD值高于對照組，差異有

7、統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（2）中氟組軟骨細胞CRT的IOD值低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；低氟組成骨細胞CRT的IOD值低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結論：1成功構建慢性氟中毒大鼠模型；骨組織形態(tài)計量及骨代謝標志物檢測結果提示氟對成骨活性與破骨活性均有影響，且與染氟劑量有關。2、63個顯著差異蛋白、15條相關通路、51個互相作用蛋白可能直接或間接地參與了慢性氟中毒骨相損害分子機制。3. M