基于iTRAQ-MS技術HIV-AIDS肺脾氣虛證差異表達蛋白研究.pdf

1、目的：運用蛋白組學相關技術篩選 HIV/AIDS肺脾氣虛證差異表達蛋白，并對差異表達蛋白進行生物信息學分析，研究差異表達蛋白的功能，探討差異表達蛋白與 HIV/AIDS肺脾氣虛證臨床證候的聯(lián)系，探索 HIV/AIDS肺脾氣虛證的生物學基礎。
　　方法：
　　1、按 HIV/AIDS肺脾氣虛證診斷量表，共納入 HIV/AIDS肺脾氣虛證患者25例，同地區(qū)健康人16例作為對照組，采集受試者血清樣本；
　　2、采用 Huma

2、n-14多重離心親和去除系統(tǒng)去除血清中高豐度蛋白，并采用SDS-PAGE凝膠電泳對高豐度蛋白去除效果進行初步評價；
　　3、運用 iTRAQ-MS技術對血清中的蛋白進行分析，質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用 Mascot軟件對 uniprot.human.fasta數(shù)據(jù)庫進行查庫鑒定分析，并采用 Proteome Discoverer軟件對肽段報告離子峰強度值進行定量分析，篩選出 HIV/AIDS肺脾氣虛證差異表達蛋白；
　　4、生物信息學分析

3、利用本地化序列比對軟件 NCBI BLAST+將鑒定到的蛋白質(zhì)與 SwissProt human數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列進行比對，利用 Blast2GO中的Mapping功能對目標蛋白比對序列所關聯(lián)的基因本體（GO）功能條目進行提取，分析目標蛋白所參與的生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）、細胞組分（Cellular Component，CC）。利用KAAS(KEGG

4、 Automatic Annotation Server)將目標蛋白序列與 KEGG GENES數(shù)據(jù)庫中的人類蛋白序列進行比對，通過同源/相似蛋白的KO（KEGG Orthology）號注釋到相關KEGG通路上，分析確定目標蛋白參與的最主要的代謝和信號轉導途徑。
　　結果：
　　1、 HIV/AIDS肺脾氣虛證組和健康對照組在年齡、性別組成、CD8水平上無顯著性差異（p＞0.05），HIV/AIDS肺脾氣虛證患者 CD4水平

5、、CD4/CD8水平較健康對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；
　　2、 SDS-PAGE凝膠電泳結果示去除高豐度蛋白后血清蛋白樣品電泳后條帶明顯增多，高豐度蛋白遮蔽作用明顯降低，不同分子量的蛋白分離清晰；
　　3、經(jīng)過去除高豐度蛋白、酶解消化、iTRAQ試劑標記、LC-MS質(zhì)譜分析、Mascot查庫共鑒定出唯一肽段（Unique Peptide）2612個，蛋白質(zhì)組（ProteinGroup）279個，其中各

6、通道標記標簽皆有定量信息的蛋白質(zhì)組195個；
　　4、以質(zhì)譜結果中組間比值改變結合t-test分析P value值進行差異表達蛋白篩選：1.以倍數(shù)改變＞1.2或＜0.83為標準，共鑒定差異表達蛋白4個，其中Apolipoprotein A-II、cDNA FLJ93143 highly similar to Homo sapiens complement component7表達上調(diào)，Leucine-rich repeat pro

7、tein1、Urea transporter2表達下調(diào)；2.以倍數(shù)改變＞1.15或＜0.87為標準，共鑒定差異表達蛋白8個，其中Serine/cysteine proteinase inhibitor clade G member1 splice variant2、Apolipoprotein A-II、cDNA FLJ93143 highly similar to Homo sapiens complement component7表

8、達上調(diào)，Zinc-alpha-2-glycoprotein、Urea transporter2、THAP domain-containing protein4、Apolipoprotein B、Leucine-rich repeat protein1表達下調(diào)；
　　5、僅以p value值＜0.05為標準篩選出24個蛋白進行生物信息學分析顯示，差異表達蛋白生物過程涉及細胞殺傷、生物粘附、多細胞組織過程、單一器官生物過程、細胞遷移、

9、復制等9個方面；分子功能涉及受體激活、轉運活化、結合3個方面；細胞組分涉及細胞成分、膜成分、細胞外區(qū)域、膜內(nèi)腔、大分子混合物5個方面；
　　6、 KEGG通路分析顯示差異表達蛋白主要涉及代謝或信號通路包括：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Fc-γ-R介導的吞噬作用、金黃色釀膿葡萄球菌感染、脂肪消化吸收、維生素消化吸收、受體激活、病毒引起的致癌作用、朊病毒疾病、補體級聯(lián)聚沉、阿米巴病10個。
　　結論：
　　1、多重親和離心去除系統(tǒng) H

10、uman-14能有效去除血清中14種高豐度蛋白，有效降低血清中高豐度蛋白對低豐度蛋白檢測的遮蔽作用，有利于對疾病相關標志物的發(fā)現(xiàn)，有利于中醫(yī)證候生物學基礎的研究。
　　2、運用iTRAQ-MS技術篩選出了HIV/AIDS肺脾氣虛證一系列差異表達蛋白，提示iTRAQ技術用于HIV/AIDS相關中醫(yī)證候生物標志物的研究有良好的前景。差異表達蛋白在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚未完全清楚，還需進一步評價其可靠性。
　　3、中醫(yī)證候作為

11、疾病發(fā)生演變過程中特定階段癥狀和體征的概括是有生物學基礎的。對篩選出的差異表達蛋白進行生物信息學分析顯示，差異表達蛋白分子功能及信號、代謝通路多與免疫和營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收相關。尿素轉運蛋白、載脂蛋白A-II、鋅-α-2-糖蛋白異常表達與HIV/AIDS肺脾氣虛證臨床癥狀：咳痰清稀、乏力氣喘、胸悶、心慌心悸、泄瀉等密切相關，可能是 HIV/AIDS肺脾氣虛證潛在的生物學基礎。
　　4、鋅-α-2-糖蛋白在蛋白和基因表達水平的下調(diào)涉及多