2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  本研究旨在探索miR-195在前列腺癌中的作用及其調(diào)控的靶基因。
  材料:
  1.人臨床組織來源:12對配對的原發(fā)性前列腺癌及癌旁良性冰凍前列腺組織從廣州市第一人民醫(yī)院組織庫獲得。
  2.動物:20只年齡在4-5周的BALB/c雄性裸鼠購買于廣東醫(yī)學實驗動物中心。
  3.細胞株:3種前列腺癌細胞株(PC3/DU145/LNCaP)是2012年從美國馬納薩斯(Manassas,VA,USA

2、)的American Type Culture Collection(ATCC)公司購買得到,而良性的前列腺上皮細胞系PrEC是從Lonza公司購買。
  方法:
  1.慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DU145和LNCaP構建miR-195過表達和抑制表達的細胞株;核酸或質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染DU145和LNCaP構建靶基因S6K1、miR-195和靶基因S6K1同時過表達等細胞株。
  2.Taylor公用數(shù)據(jù)庫分析miR-195的表達

3、水平與人前列腺癌的臨床病理特征和預后的相關性。
  3.細胞功能實驗分析miR-195在體外對前列腺癌細胞功能的影響,以及靶基因S6K1能否拮抗miR-195對前列腺癌細胞引起的效應,包括細胞增殖實驗、凋亡實驗、劃痕實驗、侵襲實驗。裸鼠皮下接種DU145和LNCaP細胞株形成裸鼠皮下移植瘤模型,用于分析miR-195在體內(nèi)對前列腺癌成瘤和轉(zhuǎn)移方面的影響。
  4.iTRAQ技術對穩(wěn)定過表達miR-195和空白對照的LNCaP

4、細胞株進行質(zhì)譜分析,探索由miR-195引起的差異表達的蛋白。結(jié)合IPA軟件和GO功能分析差異蛋白所涉及的信號通路和分子生物學功能。
  5.miRNAs靶基因預測軟件Target-Scan、miRWalk和miRanda同時預測受miR-195調(diào)控的靶基因;熒光素酶報告系統(tǒng)確認miR-195直接調(diào)控的靶基因。
  6.qRT-PCR檢測miR-195過表達和空白對照的LNCaP細胞株中候選靶基因S6K1、SMAP2、DCU

5、N1D1、SMAD4、IPO9、CAPZA2和 CPNE1的表達水平。qRT-PCR分別檢測前列腺癌細胞株PC3、DU145和LNCaP,正常前列腺上皮細胞株PrEC,以及12對前列腺癌和對應的癌旁良性前列腺組織的miR-195和靶基因S6K1的表達水平。
  7.Western bolt檢測miR-195異常表達的DU145和LNCaP細胞株以及裸鼠皮下移植瘤組織中靶基因S6K1的蛋白水平;Western bolt檢測靶基因S6

6、K1表達異常的相關細胞株構建是否成功;Western bolt檢測miR-195過表達或S6K1被抑制表達的DU145和LNCaP細胞株中靶基因S6K1下游已被研究證實的潛在效應因子MMP-9、VEGF、BAD和E-cadherin的蛋白水平。
  8.免疫組織化學分析S6K1在包含225例人前列腺癌和25例癌旁良性前列腺癌的組織芯片的表達情況;免疫組織化學分析miR-195異常表達的DU145和LNCaP細胞株接種形成的裸鼠皮下

7、腫瘤組織中CD31和Vimentin的表達情況。
  結(jié)果:
  1.相對正常前列腺上皮細胞株PrEC,miR-195在PC3、DU145和LNCaP細胞株中的表達量均顯著性下調(diào)(P<0.001); miR-195在人臨床前列腺癌組織中的表達量相對于癌旁良性前列腺組織的表達量同樣顯著性下調(diào)(P=0.020)。
  2.利用Taylor公用數(shù)據(jù)庫分析顯示miR-195的表達水平跟前列腺癌Gleason評分成顯著性負相關(

8、P=0.001),miR-195表達水平的下調(diào)與前列腺癌根治術后發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移及生化復發(fā)密切相關(P=0.01,0.009),然而,miR-195的表達水平與患者的術前血清PSA濃度、腫瘤臨床分期、腫瘤病理分期以及是否死亡不存在統(tǒng)計學意義的相關性。Kaplan-Meier和Log rank方法顯示miR-195的表達水平與患者的總體生化復發(fā)率和無轉(zhuǎn)移生化復發(fā)率存在顯著性負相關(P=0.001,0.009),但與患者的總體生存率和無轉(zhuǎn)移生存

9、率不存在統(tǒng)計學意義的相關性(P=0.721,0.806)。COX比例風險回歸模型單因素分析結(jié)果提示腫瘤病理分期、Gleason評分和miR-195的表達水平都是預測前列腺癌患者接受前列腺癌根治術后出現(xiàn)生化復發(fā)的重要指標,而年齡、術前血清PSA水平、腫瘤臨床分期不能作為判斷前列腺癌預后的預測因子。COX比例風險回歸模型多因素分析結(jié)果提示miR-195表達水平[HR:0.58(0.39-0.85)]、Gleason評分[HR:5.83(2.

10、71-12.54)]和病理分期[2.71(1.09-6.71)]能夠作為預測生化復發(fā)風險的獨立指標。
  3.體外細胞功能實驗顯示miR-195過表達的DU145和LNCaP細胞株的增殖、遷移、侵襲能力相對空白對照組明顯下降,而發(fā)生凋亡的比率明顯增加。相反,miR-195抑制表達的DU145和LNCaP細胞株的增殖、遷移、侵襲能力相對對照組明顯增加,而發(fā)生凋亡的比率明顯降低(P<0.05)。
  4.裸鼠皮下移植瘤模型顯示m

11、iR-195過表達能夠顯著性抑制由DU145和LNCaP形成的移植瘤的成瘤大小和生長速度(P<0.05);相反,miR-195的表達被抑制后移植瘤成瘤大小比對照組大,且生長速度加快。免疫組化分析結(jié)果顯示miR-195能夠顯著性抑制移植瘤組織中新生血管指標CD31和腫瘤侵襲力指標Vimentin的表達水平(P<0.05)。
  5.iTRAQ發(fā)現(xiàn)的差異性表達蛋白總共有3194個,其中有78個蛋白的差異表達倍數(shù)≤-1.5或≥1.5(m

12、iR-195 vs miR-NC),包括28個上調(diào)蛋白和50個下調(diào)蛋白。IPA軟件的KEGG通路分析顯示大部分上調(diào)蛋白參與代謝類的通路,例如檸檬酸循環(huán)、纈氨酸降解、丙氨酸生物合成、輔酶生物合成和脂肪酸氧化。大部分下調(diào)的蛋白參與mTOR通路、IL-8通路、AMPK通路和IGF-1通路等腫瘤相關通路。GO功能會聚系統(tǒng)分析結(jié)果顯示差異蛋白涉及的與腫瘤相關的生物學功能包括細胞周期、細胞侵襲、細胞形態(tài)變化和細胞運動。
  6.3個miRNA

13、s靶基因軟件共同預測50個下調(diào)蛋白中可能被miR-195調(diào)控的候選靶基因,結(jié)果顯示SMAP2、DCUN1D1、SMAD4、IP09、S6K1、CAPZA2和CPNE1為候選靶基因。qRT-PCR結(jié)果顯示SMAP2、S6K1、IP09和DCUN1D1在miR-195過表達的LNCaP細胞株和裸鼠皮下移植瘤組織中表達下調(diào)(P<0.05)。熒光素酶報告系統(tǒng)進一步揭示S6K1是miR-195直接調(diào)控的靶基因(P<0.001)。 qRT-PCR和

14、western blot證實miR-195和S6K1在前列腺癌細胞株、移植瘤和人臨床前列腺癌組織中的基因和蛋白表達水平均呈負相關的關系。
  7.體外細胞功能實驗示S6K1過表達可以拮抗miR-195對前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用,以及減緩miR-195對細胞凋亡的促進作用(P<0.05)。另外,siRNA抑制S6K1的表達后在體外對前列腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡功能的影響與miR-195對前列腺癌細胞產(chǎn)生的效應一

15、致(P<0.05)。這些結(jié)果進一步揭示了S6K1可能是miR-195發(fā)揮抑制前列腺癌進展作用下游重要的媒介。
  8.組織芯片免疫染色分析顯示前列腺癌組織標本的S6K1陽性表達率[174/225(77.3%)]顯著高于癌旁良性前列腺組織[10/25(40%)](x2=16.140,P<0.001); S6K1的陽性表達與前列腺癌患者的病理分期較晚(x2=4.396,P=0.036)、手術切緣陽性(x2=5.371,P=0.02)、

16、生化復發(fā)(x2=5.696,P=0.017)和總體生存率降低(x2=5.417,P=0.02)有關。Kaplan-Meier和Log rank方法分析結(jié)果顯示S6K1的陽性表達跟患者總體無生化復發(fā)生存率和總體生存率降低有關(P=0.011,0.022),但與無轉(zhuǎn)移生存率的降低不存在相關性(P=0.058)。
  COX比例風險回歸模型顯示S6K1可作為預測前列腺癌患者無生化復發(fā)生存率和總體生存率的獨立指標,HR(95% CI)分別

17、是2.041(1.098-3.792)和2.992(1.058-8.462)。
  9.在前列腺癌細胞株LNCaP和DU145中,抑制S6K1的表達或miR-195過表達均可以導致MMP-9和VEGF的蛋白水平下降,而E-cadherin和BAD的蛋白水平上調(diào),這結(jié)果說明MMP-9、VEGF、E-cadherin和BAD是miR-195-S6K1軸下游的重要效應因子。
  結(jié)論:
  1.miR-195在前列腺癌中是一

18、個重要的抑癌基因;miR-195通過負性調(diào)控S6K1的表達抑制人類前列腺癌的進展。
  2.miR-195和S6K1均可單獨作為預測患者在接受前列腺癌根治術后出現(xiàn)生化復發(fā)風險的指標;S6K1還可單獨作為預測前列腺癌患者總體生存時間長短的指標??傊?,有望通過檢測前列腺癌組織中miR-195和S6K1的表達水平,協(xié)助傳統(tǒng)的臨床病理指標更準確地區(qū)分低度惡性和高度惡性的前列腺癌,優(yōu)化治療方案。
  3.miR-195-S6K1信號軸

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