組蛋白乙酰轉移酶MOF在炎性疾病中的調控作用.pdf

1、炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)包括潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)，是一種遺傳因素、環(huán)境因素和免疫因素共同參與的腸道非特異性炎性疾病。其中，UC是一種主要累及腸道黏膜層，以彌漫性黏膜炎癥和潰瘍性病變?yōu)樘攸c的慢性腸炎。其發(fā)病機制目前尚不清楚，治療進展緩慢且缺乏特異性，發(fā)病率在我國有逐年上升的趨勢。我國潰瘍性結腸炎的患病率為

2、11.6/10萬，并且已成為消化系統(tǒng)常見疾病和慢性腹瀉的主要原因，且患者多為青壯年，因此日益受到重視。葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfatesodium，DSS)是一種硫酸多糖體，能誘發(fā)UC。其機制可能與免疫細胞功能失調、腸道菌群失調有關。
　　目前已有研究表明，IBD不僅與遺傳因素有關，還與DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳調控有關，這些均可以調節(jié)炎癥相關的基因的功能。
　　多發(fā)性硬化(Multiple sclero

3、sis，MS)，是一種中樞神經(jīng)脫髓鞘自身免疫病。多發(fā)生在青年人群中的。在我國發(fā)病率為萬分之五。多發(fā)性硬化病人的臨床表現(xiàn)癥狀主要有視神經(jīng)受損導致的視力下降，肢體行動不協(xié)調，大小便失禁等。由于其癥狀較為嚴重而且容易復發(fā)所以日益受到廣泛的關注。
　　實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是模仿人類MS的經(jīng)典動物模型。有研究表明CD4+CD25+ Treg細胞

4、在EAE小鼠神經(jīng)中樞高表達，并且通過局部免疫抑制調控EAE的發(fā)展。
　　Mof也叫MYST1，是一種組蛋白乙酰轉移酶，它能將組蛋白H4的第16位賴氨酸(H4K16)乙酰化，Mof也可以乙?；墙M蛋白p53、TIP5等，乙?；梢约せ罨蜣D錄。Mof在正常的細胞增殖、分化、胚胎發(fā)育、DNA損傷修復、腫瘤發(fā)生過程中起著不可替代的重要作用。研究表明Foxp3可以協(xié)助Mof完成激活靶基因轉錄的功能。腫瘤壞死因子TGF-β在Mof的作用下刺

5、激Foxp3基因的活化，表達Foxp3。因此，研究Mof對Treg細胞的調控作用可以使我們更深入的了解自身免疫疾病的發(fā)病機制。
　　研究目的:
　　通過動物模型即利用C57BL/6小鼠分別飲用3.5％的DSS溶液建立急性UC模型和體內注射MOG35-55多肽抗原建立EAE模型。通過形態(tài)學，組織病理學，分子生物學，細胞化學等試驗檢測方法，觀察UC發(fā)病小鼠腸黏膜組織與對照組相比發(fā)生的各種變化。對比EAE發(fā)病不同時期與正常組的區(qū)別

6、。進而探討組蛋白乙酰轉移酶Mof在自身免疫病發(fā)病機制中的有關作用，為人類自身免疫疾病的預防與臨床治療提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　選取同一窩出生的且體重相近的6-8周的雌性C57BL/6小鼠作為材料，隨機且平均分成兩組，每組至少3只進行以下實驗:
　　1.選取其中兩組小鼠分別用于建立急性UC模型和EAE模型。
　　2.其中UC實驗組分為DSS誘導3天和7天兩小組，收集相同部位的結腸組織，用于后續(xù)實驗;EAE

7、實驗組分為發(fā)病初期、高峰期和緩解期三個時期，收集脾臟組織。
　　3.觀察正常組與UC實驗組小鼠結腸的區(qū)別和EAE實驗組小鼠與對照組運動能力的區(qū)別，確定模型構建成功。
　　4.細胞化學染色觀察DSS誘導3天和7天的組織病理學變化及嚴重程度。
　　5.結腸組織切片進行免疫熒光雙染，觀察組蛋白乙酰轉移酶Mof和Tregs關鍵轉錄因子Foxp3的表達情況，并進行組織、細胞中的定位。
　　6.UC實驗組與對照組和EAE實驗

8、組與對照組的組織分別用TRIzol裂解細胞提取細胞總RNA，qPCR擴增，定量分析炎癥有關基因與免疫因子的相對表達量。
　　7.從兩個實驗組和對照組小鼠組織中提取總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分析Mof、Foxp3蛋白的表達變化情況。
　　8.Co-Immunoprecipitation(Co-IP)驗證Mof與Foxp3有無物理上的相互作用。
　　9.染色質免疫共沉淀(ChIP-qPCR)實驗分析小鼠組織中Mof在

9、特定基因啟動子區(qū)域的結合狀況，從而探討自身免疫病及炎癥的發(fā)病機制。
　　10.結直腸癌細胞HCT116細胞中過表達Mof,確定Mof對相關基因的調控作用。
　　實驗結果:
　　1.形態(tài)學觀察:分離C57BL/6小鼠的結腸組織，觀察UC實驗組與對照組相比，結腸長度明顯縮短，并且結腸有出血現(xiàn)象，且7天的組織變化更明顯，結腸內部明顯的觀察到血便;EAE實驗組小鼠行走緩慢，尾部無力，甚至出現(xiàn)雙后肢癱瘓。
　　2.組織的病

10、理切片:用蘇木精伊紅染色的方法鑒定，DSS飲用組小鼠的結腸粘膜層發(fā)生細胞凋亡，并伴有嚴重的黏膜脫落現(xiàn)象。
　　3.免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)組蛋白乙酰轉移酶Mof表達于結腸組織固有層細胞的細胞核中，并且與Foxp3蛋白共定位。
　　4.Mof, Foxp3，I117，Tlr3，Tlr4，Tlr5，Tlr6，Tlr7，Tlr9 mRNA活性水平的變化，以18srRNA為參照，定量分析。DSS飲用7天的小鼠結腸組織其Mof，F(xiàn)oxp3，I

11、l17的mRNA表達明顯高于對照組，Tlr4，Tlr6，Tlr9 mRNA表達水平也顯著高于對照組。DSS飲用3天的小鼠結腸組織中，Mof, Foxp3，Il17的mRNA表達與對照組相比無統(tǒng)計學差異。EAE實驗組Mof，F(xiàn)oxp3，I117的mRNA表達明顯高于對照組，且與發(fā)病程度呈正相關。Tlr4， Tlr5， Tlr7， Tlr9 mRNA表達水平也高于對照組。
　　5.SDS-PAGE凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)無論是UC實驗組還是E

12、AE實驗組組織中Mof、Foxp3蛋白表達量均高于對照組。
　　6.Co-IP實驗表明Mof與Foxp3在體內存在相互作用。
　　7.ChIP-qPCR結果表明Mof可以結合到Foxp3，Tlr3，Tlr4，Tlr5，Tlr6，RoRrt基因啟動子區(qū)。
　　8.Mof過表達的HCT116細胞中，Tlr4蛋白和Foxp3蛋白表達量與對照組對比均明顯增加。qRT-PCR結果同樣證明了相似的結果。
　　結論:
　

13、　1、本研究運用6-8周的C57BL/6小鼠作為材料，分別應用DSS葡聚糖硫酸鈉(5000D)和MOG35-55多肽誘導結腸炎癥和多發(fā)性硬化的發(fā)生，是一種建立潰瘍性結腸炎模型和實驗性變態(tài)性腦脊髓炎模型的簡便可靠的方法。這兩種模型可以用來研究人類炎性腸病的致炎機制及多發(fā)性硬化的發(fā)病機制。
　　2、本研究發(fā)現(xiàn)，除遺傳因素外，組蛋白乙酰轉移酶Mof與潰瘍性結腸炎和多發(fā)性硬化癥的發(fā)病有一定的關系，Mof通過與Foxp3相互作用從而調節(jié)炎癥