EGCG通過Ku70及其乙酰化誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞株凋亡的初步研究.pdf

1、本文對(duì)EGCG通過Ku70及其乙?；T導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞株凋亡進(jìn)行了研究。本研究分為四個(gè)部分：
　　第一章：EGCG抗肺癌A549細(xì)胞活性的研究。
　　目的：研究EGCG對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖抑制作用及凋亡誘導(dǎo)作用。
　　方法：⑴常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞，EGCG處理A549細(xì)胞;⑵MTT法測細(xì)胞的生長抑制率，形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞形態(tài)變化，雙染法流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡;3.建立A549細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，分別用生理鹽水、EGCG

2、、順鉑處理;4.定期測量并記錄腫瘤的體積，裸鼠的體重。
　　結(jié)果：①隨著EGCG處理濃度的增加及處理時(shí)間的延長細(xì)胞的存活率下降，凋亡率增強(qiáng)，細(xì)胞體積變小、變圓，胞質(zhì)濃縮，核固縮，有凋亡小體出現(xiàn)。②生理鹽水中，移植瘤隨著時(shí)間的延長，腫瘤體積明顯增大，而接受EGCG或順鉑處理的裸鼠，其移植瘤的生長受抑制，抑制率分別為37％和50％，同時(shí)EGCG組裸鼠體重較順鉑組重，毒副作用小。
　　結(jié)論：⑴EGCG作用于人肺腺癌A549細(xì)胞株，

3、有抑制增殖誘導(dǎo)凋亡的作用，呈濃度及時(shí)間依賴性。⑵EGCG對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞移植瘤的生長有抑制作用，且對(duì)裸鼠無明顯的毒副作用。
　　第二章：EGCG通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡。
　　目的：探討EGCG是否通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。
　　方法：分別用Western blot法、RT-PCR法及real-time PCR測Bax、Bcl-xl及Caspase-3(17KDa)的蛋白及

4、mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴體外實(shí)驗(yàn)中，隨著EGCG處理濃度的增加及時(shí)間的延長，Bax的mRNA及蛋白的表達(dá)量增強(qiáng)，相反Bcl-xl的表達(dá)下降，而Caspase-3(17KDa)的蛋白表達(dá)則增強(qiáng);⑵體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，較生理鹽水組相比，EGCG組腫瘤組織中Bax的mRNA及蛋白的表達(dá)量增強(qiáng)，相反Bcl-xl的表達(dá)下降，而Caspase-3的蛋白表達(dá)則增強(qiáng);均介于生理鹽水組和順鉑組之間。
　　結(jié)論：EGCG可以上調(diào)A549細(xì)胞Bax

5、的表達(dá)，下調(diào)Bcl-xl的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Caspase-3(17KDa)的表達(dá)，并呈時(shí)間和濃度依賴性。
　　第三章：EGCG通過Ku70調(diào)控肺癌細(xì)胞A549的凋亡。
　　目的：探討EGCG是否通過下調(diào)Ku70的表達(dá)誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。
　　方法：⑴分別用Western blot法、RT-PCR法及real-time PCR檢測Ku70的蛋白及mRNA的表達(dá);⑵免疫共沉淀法檢測Bax-Ku70之間的相互作用;⑶為研究K

6、u70在EGCG促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡作用中的影響，將pSliencer4.1-CMV-Ku70-shRNA轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，抑制Ku70的表達(dá)，后用EGCG處理細(xì)胞，再用Western blot測蛋白的表達(dá)，雙染法流式細(xì)胞儀測凋亡率。
　　結(jié)果：①體外實(shí)驗(yàn)中，隨著EGCG處理濃度的增加及時(shí)間的延長，Ku70 mRNA及蛋白的表達(dá)量下降，Bax-Ku70之間的相互作用減弱;②在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，較生理鹽水組相比，EGCG組腫瘤組織中K

7、u70的mRNA及蛋白的表達(dá)量低，Bax-Ku70之間的相互作用強(qiáng);③Ku70被抑制后，EGCG對(duì)A549細(xì)胞的促凋亡作用增強(qiáng)，但對(duì)Bax表達(dá)無明顯影響。
　　結(jié)論：⑴Ku70干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功;⑵EGCG可以下調(diào)Ku70的表達(dá)，減弱Bax-Ku70之間的相互作用。⑶Ku70表達(dá)的抑制可以增強(qiáng)EGCG對(duì)A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。
　　第四章：EGCG通過調(diào)控Ku70的乙酰化狀態(tài)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549的凋亡。
　　目的：探

8、討EGCG是否通過調(diào)控Ku70的乙酰化狀態(tài)誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。
　　方法：⑴免疫共沉淀法檢測Ku70乙?；癄顟B(tài);⑵為研究Ku70乙酰化狀態(tài)在EGCG促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡中的作用，將pCDNA3.1(+)-Ku70轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，使其過表達(dá)Ku70，再用點(diǎn)突變PCR克隆出pCDNA3.1(+)-Ku70539/542R，并轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，使K539和K542兩個(gè)位點(diǎn)的賴氨酸失去被乙?；墓δ?，后用EGCG處理細(xì)胞，再用Weste

9、rn blot測蛋白的表達(dá)，雙染法流式細(xì)胞儀測凋亡率，免疫共沉淀測Bax-Ku70之間的相互作用。
　　結(jié)果：①體外實(shí)驗(yàn)中，隨著EGCG處理濃度及處理時(shí)間的增加，Ku70乙酰化增強(qiáng);②在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，與生理鹽水組相比，EGCG組腫瘤組織中Ku70乙?；鰪?qiáng);③Ku70點(diǎn)突變后，EGCG對(duì)A549細(xì)胞的促凋亡作用減弱，但對(duì)Bax表達(dá)無明顯影響，而Bax-Ku70之間的相互作用增強(qiáng)。
　　結(jié)論：⑴Ku70過表達(dá)質(zhì)粒和Ku70539