遠端胃癌和賁門癌中雜合性丟失的差異研究.pdf

1、目的：腫瘤的發(fā)生是一個多階段的過程，是各種遺傳改變累積的結果，涉及癌基因的激活和腫瘤抑制基因(tumorsuppressorgene，TSG)的失活。根據(jù)Knudson的TSG失活形式的理論，檢測腫瘤細胞染色體上特定DNA多態(tài)標記，分析雜合性丟失(lossofheterozygosity，LOH)已成為目前檢測TSG失活和發(fā)現(xiàn)及定位新的TSG的重要手段之一。胃癌是一種異質性的腫瘤，遠端胃癌(adenocarcinomaofdistals

2、tomach，ADS)和賁門癌(adenocarcinomaofgastriccardia，AGC)分別具有其獨特的生物學和流行病學特征，提示這兩種腫瘤發(fā)生的遺傳學機制可能是不同的，因此探討ADS和AGC相關基因是闡明其發(fā)生分子機制，進行特異性的診斷和治療的前提。 最近的比較基因組雜交(comparativegenomehybridization，CGH)及LOH研究顯示ADS和AGC中染色體4q和8p21-p23缺失頻率較高，

3、提示染色體4q和8p21-p23上可能存在與ADS和AGC發(fā)生相關的TSG。要證實或發(fā)現(xiàn)染色體4q和8p21-p23區(qū)域內的與ADS和AGC發(fā)生相關的TSG，還需進一步精細限定這兩種腫瘤患者在這兩個染色體區(qū)域內的LOH頻率及范圍。在本文研究中，我們首先采用激光捕獲顯微切割(lasercapturemicrodissection，LCM)技術對腫瘤患者手術組織標本中正常的胃粘膜細胞及相應的腫瘤細胞進行特異性的捕獲，去除組織異質性因素后利用

4、多重置換擴增技術(multipledisplacementamplification，MDA)對LCM捕獲細胞DNA進行高質量的全基因組擴增(wholegenomeamplification，WGA)，進而利用擴增產(chǎn)物進行LOH分析。我們的前期研究結果顯示W(wǎng)GA產(chǎn)物用于LOH分析的結果是可靠的。本文中，我們選擇了15個定位于染色體4q上的微衛(wèi)星多態(tài)標記，13個定位于8p21-p23區(qū)域的微衛(wèi)星多態(tài)性標記，采用聚合酶鏈反應(polymer

5、asechainreaction，PCR)結合硝酸銀染色的方法分析了30例ADS和16例AGC手術切除標本的LOH情況，以期確定與ADS和AGC發(fā)生有關的TSG的缺失區(qū)域，比較二者的LOH差異。 材料與方法1.激光捕獲顯微切割特異性捕獲細胞46例新鮮胃癌切除標本，其中ADS30例、AGC16例立即分別切取非癌胃粘膜和原發(fā)癌灶，OCT包埋，液氮中保存。8μm厚連續(xù)冷凍切片，按NIH推薦程序行HE染色。采用LM200型LCM系統(tǒng)，分

6、別獲取正常胃粘膜細胞、原發(fā)灶癌細胞各約5000個。 2.LCM捕獲細胞的基因組DNA提取將載有細胞的塑料帽置于預先加有30μlDNA裂解緩沖液的0.5ml離心管，37℃水浴16h。 3.全基因組多重置換擴增根據(jù)Genomiphi說明書進行MDA擴增。每份樣品重復兩次MDA擴增，將兩次擴增產(chǎn)物混勻，并稀釋20倍用于LOH分析。 4.微衛(wèi)星標記的選擇從UCSC人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫和Marshfield數(shù)據(jù)庫選取28個

7、覆蓋染色體4q(n=15)和8p21-p23(n=13)的微衛(wèi)星標記。 5.LOH分析在10μlPCR反應體系中加入0.5μl稀釋20倍的全基因組擴增產(chǎn)物，1μl10×ExTaq緩沖液，0.8μl2.5mmol/LdNTPs，0.05μlExTaq聚合酶、0.8μl10μmol/L的引物混合物。94℃變性1min后，94℃30s，55℃75s，72℃15s，30個循環(huán)，最后72℃延伸6min。取2μlPCR產(chǎn)物與8μl甲酰胺變性

8、示蹤液稀釋混合，98℃變性8min，冰上冷卻5min。加樣5μl于8％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(含7M尿素)，500v電泳，室溫2.5h。電泳結束，根據(jù)標準的硝酸銀染色方法進行染色。觀察等位片段大小及信號強度。所有出現(xiàn)LOH的結果，重復PCR及電泳進行驗證。 6.LOH的判定相對于配對的正常組織，腫瘤組織DNA的一條等位基因條帶密度減少70％以上時可判為LOH。 7.統(tǒng)計學分析分析ADS和AGC之間各個微衛(wèi)星標記的LOH差

9、異及LOH與臨床病理參數(shù)之間的關系。所用統(tǒng)計學方法為雙側Fisher檢驗，P＜0.05被認為統(tǒng)計學上有顯著意義，所用的統(tǒng)計軟件為SPSS11.0. 結論：1.我們應用PCR為基礎的LOH分析方法對激光捕獲顯微切割的30例ADS和16例AGC手術切除標本及其配對的正常組織中染色體4q和8p21-p23區(qū)的LOH作了較詳細的研究。 2.我們篩選出一個與ADS發(fā)生特異相關的染色體4q的共同丟失區(qū)域即4q32.2-35.1，兩個

10、與AGC發(fā)生特異相關的染色體4q的共同丟失區(qū)域4q13.3-4q24和4q31.21-4q35.1。這些區(qū)域內可能存在分別與ADS和AGC發(fā)生有關的多個TSG，可以指導進一步進行這些位點附近的高密度微衛(wèi)星標記的LOH分析，確定這些位點附近的最小缺失片段，縮小遺傳學距離，為尋找新的TSG奠定基礎。 3.我們篩選出兩個與ADS發(fā)生特異相關的染色體8p21-p23區(qū)域內的共同缺失區(qū)域即D8S1099-8p23ATGG和D8S1130-

11、D8S1106，物理距離分別為2.2Mb和1Mb，一個與AGC發(fā)生相關的共同缺失區(qū)域為8p22GGAA-8p22ATCT(1.2Mb)?？s小了染色體8p21-p23區(qū)域LOH的物理距離，為進一步的定位和克隆與ADS和AGC發(fā)生相關的TSG提供了重要資料。而且這三個區(qū)域彼此不重疊，表明ADS和AGC的發(fā)生過程中可能有不同的染色體改變。 4.D4S3254位點的缺失顯示出與AGC發(fā)生相關的趨勢，此區(qū)域內的TSG可能與AGC和ADS的