OLC1的泛素化降解機(jī)制研究以及β-catenin在人食管鱗癌中的表達(dá)和預(yù)后分析.pdf

1、OLC1(overexpressed in lung cancer)是一個(gè)潛在的原癌基因,在人肺癌和食管鱗癌中均發(fā)現(xiàn)有異常高表達(dá)。已有報(bào)道證實(shí)OLC1(又名Ist1)在有絲分裂的最后一步胞質(zhì)分裂中發(fā)揮了重要作用。本室前期研究工作提示OLC1可能是通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解的。
　　 在本文第一部分的研究中,我們首先采用血清饑餓、Nocodazole處理的方式將細(xì)胞同步化并釋放24h,經(jīng)Western Blot檢測(cè)后第一次證明了O

2、LC1的蛋白表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴性。隨后,使用蛋白合成抑制劑CHX處理細(xì)胞,研究結(jié)果表明OLC1是一個(gè)短效蛋白。再加入蛋白酶體抑制劑MG132與CHX共同處理細(xì)胞,并檢測(cè)了OLC1與泛素之間的相互作用,結(jié)果證實(shí)OLC1是通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解的。我們將OLC1蛋白的序列經(jīng)BLAST后在其第12-20位氨基酸處發(fā)現(xiàn)了一個(gè)破壞框結(jié)構(gòu)域Destruction Box,而該D-box恰好是后期促進(jìn)復(fù)合體APC/C(AnaphasePromo

3、ting Complex/Cyclosome)特異性識(shí)別的結(jié)構(gòu)域。為了證實(shí)介導(dǎo)OLC1降解的泛素連接酶E3就是APC/C,我們使用IP實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)OLC1與APC/C的亞基APC2之間是否存在相互作用,得到了陽(yáng)性結(jié)果。此外,通過(guò)轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)?；蛘遱iRNA敲降技術(shù)來(lái)上調(diào)/下調(diào)與APC/C關(guān)系緊密的共激活因子Cdc20/Cdh1的蛋白水平后,發(fā)現(xiàn)Cdc20/Cdh1可以加快OLC1的降解。最后,我們還構(gòu)建了D-box序列突變的OLC1質(zhì)粒來(lái)研

4、究其降解機(jī)制,研究發(fā)現(xiàn)降解結(jié)構(gòu)域突變體可以大大增強(qiáng)OLC1蛋白的穩(wěn)定性,并且轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒后可以引起細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快、克隆形成能力增強(qiáng)。
　　 在本文第二部分的研究中,我們通過(guò)組織芯片、免疫化學(xué)方法檢測(cè)211例手術(shù)切除的人食管鱗癌(ESCC)術(shù)后標(biāo)本中β-catenin的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn),β—catenin在人食管鱗癌組織中以細(xì)胞漿定位為主,其表達(dá)陽(yáng)性率(64.5％)要明顯高于癌旁正常組織(5.7％,P<0.05)。同時(shí),應(yīng)用X2

5、檢驗(yàn)分析了β-catenin的表達(dá)與臨床病理特征間的相關(guān)性,應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)β-catenin高表達(dá)的食管鱗癌病人預(yù)后較差(P=0.010),接下來(lái)通過(guò)Cox多因素分析證實(shí)β-catenin是食管鱗癌病人的一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素(P=0.026)。
　　 綜上所述,第一部分的研究證實(shí)了OLC1的蛋白表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴性,OLC1是通過(guò)APC/C介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體途徑降解的。另外,第二部分的研究證實(shí)β-ca