喹諾酮類藥物氧氟沙星致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷的機(jī)制研究.pdf

1、本研究以喹諾酮類代表藥物氧氟沙星為研究對象，以藻酸微囊包被立體培養(yǎng)的幼齡兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為試驗?zāi)Ｐ?，從?xì)胞凋亡、β1整合素功能、ERK/MAPK信號通路以及凋亡發(fā)生所涉及的信號通路等幾個方面來深入探討QNs致幼齡動物關(guān)節(jié)軟骨損傷的可能機(jī)制。通過利用MTT試驗、熒光雙染凋亡定量試驗、RT-PCR、Western blot、免疫共沉淀試驗、DMB試驗以及凋亡酶活性試驗等，得到如下結(jié)果： 1、單層培養(yǎng)和三維微囊培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的形態(tài)和功能比

2、較。單層培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)扁平、伸長的纖維狀形態(tài)；而三維微囊培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞則保持正常生理狀態(tài)下的球形形態(tài)。單層培養(yǎng)軟骨細(xì)胞表達(dá)高水平的Ⅰ型膠原，而Ⅱ型膠原和蛋白多糖則表達(dá)很少；三維微囊培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的這些特征性產(chǎn)物表達(dá)則正好與單層培養(yǎng)相反，這些立體培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞表達(dá)高水平的Ⅱ型膠原和蛋白多糖，而Ⅰ型膠原表達(dá)量低。其表達(dá)模式與代表生理狀態(tài)下軟骨狀態(tài)的組織塊軟骨細(xì)胞相似。以上數(shù)據(jù)表明，三維微囊培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞更能體現(xiàn)生理狀態(tài)下軟骨細(xì)胞的形態(tài)和功

3、能； 2、氧氟沙星以時間和濃度依賴的方式使軟骨細(xì)胞存活率下降，且存活率的下降主要是由凋亡所致。此外，10μg/ml的氧氟沙星(與臨床相關(guān)的濃度)可以明顯誘導(dǎo)多聚二磷酸腺苷核糖酸多聚酶(Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)分解，caspase-3激活以及DNA梯度片段形成，這些凋亡特征性指標(biāo)進(jìn)一步確證了凋亡的發(fā)生。因此，以上結(jié)果表明，氧氟沙星主要是通過凋亡的方式致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷； 3、10 μ

4、g/ml的氧氟沙星在作用軟骨細(xì)胞48時后使β1整合素受體、磷酸化的細(xì)胞外信號調(diào)控激酶1/2(phospho-extracellular signal-regulatedkinase 1/2，phospho-ERK1/2)以及生長因子受體結(jié)合蛋白2(Growth factotreceptot-bound protein 2，Grb 2)表達(dá)顯著降低。但是卻沒有引起β1整合素的mRNA表達(dá)改變。此外，氧氟沙星使β1整合素受體不與激活的細(xì)胞內(nèi)

5、信號蛋白相互作用。在補(bǔ)充足夠鎂離子的條件下，氧氟沙星不能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡以及使β1整合素受體表達(dá)下降。以上結(jié)果表明，從給藥后48小時開始，氧氟沙星通過影響β1整合素受體功能，抑制ERK/促分裂原活化蛋白激酶(ERK/Mitogen-activated protein kinase，ERK/MAPK)信號通路而引起軟骨細(xì)胞凋亡； 4、10 μg/ml的氧氟沙星可以激活凋亡酶caspase-8，但是對Caspase-8的抑制不影響氧

6、氟沙星對phospho-ERK1/2和β1整合素受體蛋白表達(dá)的影響。 Caspase-9特異性抑制劑zLEHD-fmk和Caspase-8特異性抑制劑zIETD-fmk以濃度依賴的方式減弱氧氟沙星誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡和Caspase-3激活；Caspase-8特異性抑制劑zIETD-fmk明顯抑制氧氟沙星誘導(dǎo)的Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3活化，而Caspase-9特異性抑制劑zLEHF-fmk則僅僅抑

7、制Caspase-9和Caspase-3的活化。以上結(jié)果表明，在作用48小時后，氧氟沙星通過影響β 1整合素受體功能而激活Caspase-8，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡； 5、10 μg/ml氧氟沙星也以濃度依賴的方式使細(xì)胞色素c從線粒體轉(zhuǎn)移到胞漿以及線粒體膜電位降低，而Caspase-8特異性抑制劑則可以完全抑制以上效應(yīng)。此外，氧氟沙星以濃度和時間依賴的方式使Bcl-2家族蛋白Bax、tBid和p53表達(dá)增加，而VDAC、Bcl-2和Bcl-x

8、L的表達(dá)則不受影響。以上結(jié)果表明，氧氟沙星引起的軟骨細(xì)胞凋亡主要是通過Caspase-8依賴的線粒體通路。 本研究的結(jié)果表明了氧氟沙星主要是通過依賴于Caspase-8的線粒體凋亡通路誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡而致關(guān)節(jié)軟骨損傷；而凋亡的發(fā)生是由于β1整合素的功能改變所致，與β1整合素的表達(dá)無關(guān)。初步推測其機(jī)制可能為：在氧氟沙星作用48小時后，由于氧氟沙星使β1整合素受體的構(gòu)象改變，不能與胞外相應(yīng)的配體結(jié)合，從而影響了其正常功能。因此，未結(jié)