輪狀病毒P[2]G3株和P[8]G1株對(duì)Vero細(xì)胞的適應(yīng)性培養(yǎng)及滅活研究.pdf

1、輪狀病毒(rotavirus，RV)是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒重癥腹瀉最主要的病原之一，也是造成發(fā)展中國(guó)家兒童死亡的重要原因，占所有腸道感染病因的50％以上[1]。RV屬于呼腸孤病毒科，按其結(jié)構(gòu)蛋白VP6抗原性不同可分為A～G7個(gè)組。A組主要感染嬰幼兒，現(xiàn)有的RV疫苗也是針對(duì)A組開(kāi)發(fā)的。輪狀病毒腹瀉已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，給社會(huì)帶來(lái)沉重的疾病負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前尚無(wú)治療該腹瀉的特效藥物，而且水質(zhì)和衛(wèi)生條件的改善并不能明顯降低輪狀病毒腹瀉

2、的發(fā)病率。因而開(kāi)發(fā)高效、安全、廉價(jià)的病毒疫苗是預(yù)防、控制輪狀病毒感染的唯一可行辦法。世界衛(wèi)生組織(WHO)對(duì)輪狀病毒疫苗的研究開(kāi)發(fā)給予了高度重視?，F(xiàn)階段臨床中使用的RV疫苗均是口服減毒的活疫苗，在易感人群中取得了很好的免疫效果和保護(hù)作用。但因其存在返祖、陽(yáng)轉(zhuǎn)的危險(xiǎn)及潛在的嚴(yán)重副反應(yīng)(腸套疊)，已不再被看作疫苗研究的主流。一批新型疫苗的研究正處于動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)階段，如亞單位疫苗、病毒樣顆粒(VLP)、滅活疫苗、DNA疫苗和轉(zhuǎn)基因植物疫苗。這

3、些腸道外疫苗雖尚未到達(dá)臨床觀察階段，但在動(dòng)物模型中都有一定的保護(hù)效應(yīng)，顯示出潛在的應(yīng)用價(jià)值。其中滅活疫苗因其安全性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，日益成為RV疫苗研究的熱點(diǎn)。 本研究將蝕斑篩選、純化得到的RV兩個(gè)血清型P[2]G3株(SA11株)和P[8]G1株(Wa株)適應(yīng)培養(yǎng)至Vero細(xì)胞，以滿足利用微載體技術(shù)規(guī)?；囵B(yǎng)病毒的需要。在連續(xù)傳代的過(guò)程中，確定了病毒接種的最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MO

4、I)為0.05；并繪制出病毒在Vero細(xì)胞上的增殖曲線，結(jié)果顯示：病毒接種后第3～4d，感染性滴度達(dá)最大值：SA11株(第9代)為7.0 CCID50/ml，Wa株(第9代)為6.25 CCID50/ml，之后滴度有所回降。兩株病毒經(jīng)連續(xù)傳代均可獲得較高的感染性滴度：SA11株(第10代)為7.25 CCID50/ml左右，Wa株(第10代)為6.5 CCID50/ml左右。通過(guò)病毒基因組RNA聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)鑒定，兩株輪

5、狀病毒在傳代過(guò)程中保持了一致的核酸帶型，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。利用Vero細(xì)胞微載體技術(shù)規(guī)?；囵B(yǎng)輪狀病毒，病毒收獲液的滴度比靜置培養(yǎng)時(shí)略高：SA11株(第9代)為7.25 CCID50/ml，Wa株(第9代)為6.75 CCID50/ml。使用β-丙內(nèi)酯、甲醛以及加熱的方法對(duì)收獲的病毒液進(jìn)行滅活，滅活后在MA104細(xì)胞上盲傳3代檢測(cè)滅活效果，僅MA104細(xì)胞培養(yǎng)的SA11株和利用Vero細(xì)胞微載體技術(shù)規(guī)?；囵B(yǎng)的SA11株在56℃水浴

6、加熱30min后加入1:4000(v/v)β-丙內(nèi)酯4℃攪拌8d的滅活樣品被徹底滅活，電鏡下可見(jiàn)完整的病毒顆粒。用Sepharose 4FF凝膠過(guò)濾柱純化Wa株病毒濃縮液，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)分析，280nm處第一峰即為純化病毒峰，Bradford法測(cè)定病毒純化樣品的蛋白濃度為0.788mg/ml。 本研究成功將輪狀病毒兩個(gè)血清型SA11株和Wa株適應(yīng)培養(yǎng)至Vero細(xì)胞，并通過(guò)微載體技術(shù)規(guī)模化培養(yǎng)輪狀