嬰幼兒腹瀉常見(jiàn)病毒的多重PCR檢測(cè)及輪狀病毒G、P分型研究.pdf

1、[目的]
　　 1.建立一種檢測(cè)引起嬰幼兒急性腹瀉常見(jiàn)病毒的多重PCR方法，探討影響多重PCR擴(kuò)增的因素。
　　 2.將建立的多重檢測(cè)方法應(yīng)用于臨床嬰幼兒腹瀉標(biāo)本，對(duì)多重檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，使多重方法能夠直接檢測(cè)并鑒別臨床標(biāo)本中相應(yīng)的腹瀉病毒。
　　 3.初步了解深圳地區(qū)引起臨床嬰幼兒急性腹瀉的常見(jiàn)病毒的病原分布情況，為臨床防治提供依據(jù)。
　　 4.對(duì)引起臨床嬰幼兒急性腹瀉的主要病原-A組輪狀病毒進(jìn)行常見(jiàn)G

2、、P分型分析，為輪狀病毒疫苗的研究和開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)資料。
　　 [方法]
　　 1標(biāo)本采集與處理
　　 收集深圳市第四人民醫(yī)院2007年8月～2009年2月5歲以下急性非細(xì)菌性腹瀉嬰幼兒的糞便標(biāo)本413份，其中男性224例，女性189例。標(biāo)本用生理鹽水混勻，制成10％的懸液，于-30℃保存。
　　 2引物設(shè)計(jì)
　　 通過(guò)查閱文獻(xiàn)，在GeneBank中分別找到輪狀病毒(Rotavirus，RV)A組、

3、星狀病毒(Astrovirus，AstV)、諾如病毒(Norovirus，NV)和腸道腺病毒(Entericadenovirus，EAdV)4種腹瀉病毒對(duì)應(yīng)的特異基因序列，分析病毒基因組保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)基因序列，使用Primer5.0和Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)、評(píng)價(jià)PCR擴(kuò)增引物。
　　 3多重PCR方法檢測(cè)嬰幼兒急性腹瀉常見(jiàn)病毒
　　 優(yōu)化反應(yīng)體系，建立RNA腹瀉病毒多重PCR篩查體系。陽(yáng)性產(chǎn)物用測(cè)序引物二次擴(kuò)增，經(jīng)

4、測(cè)序予以確證。
　　 4單重PCR法篩查臨床腹瀉標(biāo)本EAdV，陽(yáng)性產(chǎn)物經(jīng)純化測(cè)序確證。
　　 5用巢式PCR法結(jié)合測(cè)序?qū)組RV陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行常見(jiàn)的G、P分型。
　　 6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(X2 test)或者確切概率法，雙側(cè)α=0.05，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 1、所設(shè)計(jì)引物Tm值相近，在同一條件下均獲得較

5、好的擴(kuò)增。擴(kuò)增片段大小有差異，能夠用瓊脂糖凝膠電泳的方法區(qū)分開(kāi)來(lái)，引物均只對(duì)預(yù)期的片段進(jìn)行擴(kuò)增。
　　 2、根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，我們主要探討了以下幾個(gè)影響反應(yīng)的因素，并進(jìn)行了調(diào)整，包括退火溫度、緩沖液的濃度、酶、引物的濃度等。通過(guò)優(yōu)化以上條件，各對(duì)引物對(duì)應(yīng)的條帶可以獲得比較均一的擴(kuò)增。
　　 3、在413份標(biāo)本中，共檢出292例至少感染一種腹瀉病毒，總檢出率為70.70％(292/413)，其中241例為一種病毒感染，51例(

6、12.35％)為混合感染。四種腹瀉病毒以RV感染為主，檢出率為52.54％(217/413)；其次是NV，檢出率為16.95％(70/413)；AstV檢出率為7.75％(32/413)；EAdV檢出率為6.54％(27/413)。混合感染以RV合并其他病毒感染為主，占88.24％。
　　 4、研究發(fā)現(xiàn)，RV和NV是引起嬰幼兒急性腹瀉的主要致病原。RV腹瀉發(fā)病高峰在10～1月份，高峰期檢測(cè)陽(yáng)性率為65.56％。NV腹瀉發(fā)病高峰除

7、在10～1月份外，在7～9月也有一次高峰。
　　 5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，90.07％的腹瀉病毒感染患兒年齡在2歲以下，AstV腹瀉發(fā)病年齡最小，EAdV腹瀉年齡最大，RV和NV介于中間。四種病毒均在6～24月齡組發(fā)病率最高，以RV發(fā)病高峰最明顯。
　　 6、RV G、P血清型基因分析顯示，G1P[8]、G3P[8]、G9P[8]和G2P[4]四種型別是深圳地區(qū)A組輪狀病毒的主要病毒血清型，占P分型陽(yáng)性總數(shù)的87.13％，其中

8、G3P[8]占50.99％，G1P[8]占32.67％，G2P[4]占1.98％和G9P[8]占1.49％。還檢測(cè)到其它較少見(jiàn)的血清型，包括G3P[4]，占P型總數(shù)的3.96％。另外，混合感染13株，占P型的6.44％。
　　 [結(jié)論]
　　 1實(shí)驗(yàn)證明，所建立的多重PCR技術(shù)能夠一次性檢測(cè)出嬰幼兒腹瀉標(biāo)本中的常見(jiàn)病毒，其敏感性、特異性和可重復(fù)性好，為常見(jiàn)腹瀉病毒的檢測(cè)提供了一種方便易行的方法。
　　 2 RV及