貴州茅臺酒與肝癌發(fā)生的相關(guān)性及對大鼠肝藥酶的影響.pdf

1、目的：1.探討飲用貴州茅臺酒（以下簡稱茅臺酒）與原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）發(fā)生的相關(guān)性，通過回顧性人群病例對照研究，以比值比（OR）表示相對危險度，探索飲用茅臺酒與HCC的發(fā)生是否具有統(tǒng)計學(xué)聯(lián)系。
　　2.探討茅臺酒對復(fù)合因素所致肝癌大鼠肝組織P53基因突變的影響。
　　3.探討茅臺酒對大鼠酒精代謝相關(guān)酶中乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）、細(xì)胞色素P4502E1（CYP2E1）的影響。
　　方法：第一部分

2、r>　　1.人群選擇2010年12月到2011年12月在貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、貴州省腫瘤醫(yī)院、茅臺酒廠職工醫(yī)院及各地州市醫(yī)院等9家單位就診的HCC患者及相應(yīng)住地人群開展相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查。
　　2. HCC入選病例的診斷方法：參照中國抗癌協(xié)會關(guān)于HCC的最新診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：轉(zhuǎn)移性肝癌、炎性假瘤、自身免疫性肝病、遺傳性肝病等影響因素。
　　3.飲酒暴露因素標(biāo)準(zhǔn)：飲酒定義為每周飲酒兩次以上,時間超過1年。飲用

3、茅臺酒組劃分為完全飲用或非完全飲用。
　　4.病例組與對照組的比較方法：采用成組病例對照研究。
　　5.問卷調(diào)查、體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查：所有測量均由專業(yè)醫(yī)護(hù)人員按統(tǒng)一的規(guī)范進(jìn)行。
　　6.記錄并且整理相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)。
　　7.數(shù)據(jù)錄入SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析：卡方檢驗(yàn)、分層分析、單因素非條件Logistic回歸分析；將單因素分析有意義的自變量帶入多因素Logistic回歸模型，調(diào)整混雜因素，計算飲用茅臺酒

4、的OR值，探討飲用茅臺酒與HCC發(fā)生的相關(guān)性。
　　方法：第二部分
　　1.動物模型的建立：以大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停⌒坌訵istar大鼠130只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)取10只作為正常對照組（A組），余大鼠隨機(jī)平均分為四組（每組30只），茅臺酒低劑量組（B組）和高劑量組（C組），普通白酒低劑量組（D組）和高劑量組（E組）。低劑量組劑量為5ml/kg，高劑量組劑量為10ml/kg，每天早上灌胃一次（5d/w），相同飼料喂養(yǎng)，飲水自

5、由。24w末參照文獻(xiàn)進(jìn)行肝癌短期造模。黃曲霉素B1（AFB1）腹腔注射，400μg/kg/次，一次/d，6次/w，連續(xù)2w。停用AFB12w后，換飼含0.015％二乙酰氨基芴(AAF)的飼料2w。灌胃8w、16w、24w末各組隨機(jī)選取2只大鼠處死，留取血清及肝臟,肝臟稱重后取一部分新鮮肝組織置于-80℃凍存?zhèn)溆?，另一部分?%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片及HE染色。短期造模后處死余下大鼠，標(biāo)本處理同前。
　　2.檢測指標(biāo)：
　

6、　2.1肝臟病理學(xué)檢查常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色，選取石蠟包埋的肝組織蠟塊，切片并進(jìn)行HE染色，觀測肝臟的病理組織學(xué)改變，本部分由貴陽醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室協(xié)助完成。
　　2.2結(jié)締組織染色采用Masson三色法，觀察肝組織內(nèi)膠原纖維沉積程度，本部分由貴陽醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室協(xié)助完成。
　　2.3血清學(xué)檢測透明質(zhì)酸（HA）、Ⅳ型膠原（ColⅣ）定量測定（化學(xué)發(fā)光法）。
　　2.4 P53基因的突變檢測
　　2.4.1

7、提取肝組織DNA按照試劑盒說明書進(jìn)行。
　　2.4.2引物設(shè)計本部分由北京鼎國生物技術(shù)有限公司合成。
　　2.4.3 P53基因變異的直接測序本部分由北京鼎國生物技術(shù)有限公司合成。
　　方法：第三部分
　　1.動物模型的建立：（1）以大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?5只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對照組（A組）、乙醇組（5 ml/kg，B組，乙醇用蒸餾水稀釋至530 g/L濃度）、白酒高劑量組（10 ml/kg，C組）、

8、白酒中劑量組（5 ml/kg，D組）、白酒低劑量組（2.5 ml/kg，E組），每組15只。白酒組及乙醇組再以蒸餾水稀
　　釋1倍灌胃，空白對照組以蒸餾水灌胃（5 ml/kg），1次/d，共7 d。全部大鼠于末次灌胃1 h和12 h后眼眶采血[5]，然后股動脈放血處死，常規(guī)留取血清，并且留取全部肝臟，肝臟稱重后取一部分新鮮肝臟置于-80℃凍存?zhèn)溆茫硪徊糠忠?%甲醛溶液固定。（2）雄性 Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為空白對照組（

9、10ml·kg-1，A組，10只）、茅臺酒組（10ml·kg-1，B組,15只）、乙醇組（10ml·kg-1,C組，15只，乙醇用蒸餾水稀釋至530g/L濃度）。茅臺酒組及乙醇組再以蒸餾水稀釋1倍灌胃，空白對照組以蒸餾水灌胃，1次/d，6次/w，連續(xù)12w。全部大鼠于末次灌胃12h后股動脈放血處死，常規(guī)留取血清，并且留取全部肝臟，肝臟稱重后取一部分新鮮肝臟置于-80℃凍存?zhèn)溆?，另一部分?%甲醛溶液固定。
　　2.檢測指標(biāo)：

10、>　　2.1生化方法檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST），頂空-氣相色譜法測定血液中乙醇、乙醛含量；酶聯(lián)免疫法檢測肝組織勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）含量。
　　2.2病理學(xué)檢測
　　取相同部位（肝右葉）組織用中性甲醛固定，乙醇逐級脫水，常規(guī)石蠟包埋后切片，HE染色，觀察肝臟的病理組織學(xué)改變。本部分

11、由貴陽醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室協(xié)助完成。
　　2.3 Real Time RT-PCR檢測肝組織中ADH1、ALDH2、CYP2E1 mRNA的表達(dá)。
　　2.4免疫組織化學(xué)檢測肝組織中ADH1、ALDH2、CYP2E1蛋白的表達(dá)。
　　2.5 Western Blotting檢測肝組織中ADH1、ALDH2、CYP2E1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　第一部分，病例組吸煙者210例（27.6%）、非酒精性脂肪肝3

12、36例（44.1%）、酒精性肝病245（32.2%）、HCC家族史141例（16.5%）、飲酒者300例（39.4%）、乙型肝炎病毒（HBV）感染者436（57.2%）、經(jīng)常進(jìn)食腌制、霉變食物290例（38.1%）、5年前經(jīng)濟(jì)狀況好152例（19.9%）；對照組，吸煙者116例（14.5%）、非酒精性脂肪肝160例（20.1%）、酒精性肝病101例（12.7%）、HCC家族史40例（5.0%）、飲酒者180例（22.6%）、HBV感染8

13、2例（10.3%）、經(jīng)常進(jìn)食腌制、霉變食物225例(28.2%)、5年前經(jīng)濟(jì)狀況好352例（44.1%）。其OR值分別為3.520、2.464、4.330、2.219、2.451、19.245、6.212、0.174,P值均＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；分層分析發(fā)現(xiàn)：酒精攝入量≤25g/d和＞25g/d的調(diào)整OR值分別為0.474、4.909；飲酒年限≤20年和＞20年的調(diào)整OR值分別為1.865、4.345，其中飲酒合并HBV感染者的

14、調(diào)整OR值達(dá)96.903；完全飲用茅臺酒和非完全飲用茅臺酒的調(diào)整OR值分別為0.340、1.812，在適量飲酒人群中（酒精攝入量≤25g/d），完全飲用茅臺酒和非完全飲用茅臺酒的調(diào)整OR值分別為0.331、0.775，在過量飲酒人群中（酒精攝入量＞25g/d），完全飲用茅臺酒和非完全飲用茅臺酒的調(diào)整OR值分別為1.269、5.932。
　　第二部分，成功復(fù)制AFB1加飲酒誘導(dǎo)大鼠肝癌模型。造模過程中，因多種原因茅臺酒組死亡14只，

15、白酒組死亡18只大鼠，正常對照組無死亡。單純灌胃2月末，普通白酒高劑量組隨機(jī)處死的2只大鼠肝臟均發(fā)現(xiàn)有纖維增生，肝細(xì)胞點(diǎn)灶狀壞死，匯管區(qū)見短窄纖維增生。其余四組未見纖維增生。4月末，普通白酒低劑量組1只、普通白酒高劑量組2只大鼠肝臟纖維增生。茅臺酒組表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞點(diǎn)灶狀壞死。6月末，茅臺酒低劑量組1只、茅臺酒高劑量組、普通白酒低、高劑量組各2只大鼠觀測到肝臟纖維增生。經(jīng)過2個月肝癌模型短期復(fù)制，茅臺酒低劑量組1只、茅臺酒高

16、劑量組6只、普通白酒低劑量組7只、普通白酒高劑量組6只觀測到肝硬化。茅臺酒高劑量組1只、普通白酒高劑量組5只觀測到肝硬化并肝癌。茅臺酒組肝纖維化、肝硬化并肝癌的發(fā)生率均比白酒組低。正常對照組未發(fā)現(xiàn)肝臟纖維增生。P53基因的突變檢測：成功擴(kuò)增54例P53基因5、6、7、8號外顯子，測序顯示突變方式以堿基插入為主，其次為堿基突變及缺失。茅臺酒組突變率為42.3%，白酒組突變率為78.3%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　第三

17、部分（1）與乙醇組比，末次灌胃12h后茅臺酒中、低劑量組大鼠血中乙醇、乙醛含量明顯降低（P＜0.01）；在大鼠肝勻漿中，茅臺酒高、中、低劑量組SOD、GSH-PX均明顯增高（P＜0.01），茅臺酒中、低劑量組MDA明顯降低（P＜0.01），茅臺酒低劑量組 ADH明顯增高（P＜0.01），茅臺酒高、中、低劑量組ALDH均明顯增高（P＜0.01）；肝組織中，茅臺酒低劑量組ADH1 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增高（P＜0.01），茅臺酒高、中、

18、低劑量組 ALDH2 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯增高（P＜0.01）。上述檢測指標(biāo)在茅臺酒高、中、低劑量組之間相互比較，均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。（2）茅臺酒組及乙醇組大鼠肝組織切片HE染色均可見不同程度肝細(xì)胞脂肪變性及炎性細(xì)胞浸潤，但茅臺酒組顯著較少（P＜0.05）；與空白對照組及乙醇組比，末次灌胃12h后茅臺酒組大鼠肝組織勻漿中SOD、GSH-PX均顯著較高（P＜0.01），與乙醇組比，末次灌胃12h后茅臺酒組大鼠肝組織勻漿

19、中 MDA顯著較低（P＜0.01）；與空白對照組比，茅臺酒組大鼠肝組織中CYP2E1 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)較高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與乙醇組比，茅臺酒組大鼠肝組織中CYP2E1 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)顯著較低（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1. HBV感染、經(jīng)常食用腌制或霉變食物為貴州人群HCC常見的危險因素，吸煙及過度飲酒也可增加患HCC的風(fēng)險，同時飲酒還可增加HBV感染者患HCC的風(fēng)險；完全飲用茅臺酒的人