雙靶修飾策略同時實現(xiàn)阿霉素脂質體腫瘤細胞高度識別與攝取.pdf

1、目的：構建葉酸（Folate， FA）、TAT肽雙靶修飾阿霉素脂質體（FA/TAT-LP-DOX），旨在實現(xiàn)FA主動靶向的同時，增強阿霉素脂質體的細胞攝取，從而提高其抗腫瘤效果；同時研究雙靶脂質體FA/TAT-LP-DOX的攝取途徑，闡明其發(fā)揮作用的機理。
　　方法：通過酰胺化反應合成脂質材料長鏈DSPE-PEG5000-FA，加成反應合成短鏈DSPE-PEG2000-TAT，以薄層色譜（TLC）、紅外光譜（FTIR）、氫譜（1H

2、-NMR）、高效液相色譜（HPLC）等方法分別對合成產(chǎn)物進行表征。采用薄膜分散法及pH梯度法制備阿霉素脂質體（LP-DOX），后插入法制備雙靶脂質體。通過測定粒徑、Zeta電位、形態(tài)、包封率對脂質體進行表征。體外評價中以過度表達葉酸受體的KB細胞作為細胞模型。采用 MTT法評價雙靶脂質體的細胞毒性；通過熒光顯微鏡及流式細胞儀定性定量考察雙靶脂質體的攝取效率；應用激光共聚焦顯微鏡觀察雙靶脂質體在細胞內的分布情況；最后通過流式細胞儀及共聚焦

3、顯微鏡考察不同抑制劑的攝取抑制作用來闡明雙靶脂質體的內吞機制。
　　結果：脂質材料DSPE-PEG5000-FA經(jīng)1H-NMR鑒定，其純度約為75%，DSPE-PEG2000-TAT經(jīng)HPLC計算，其TAT肽連接率約為95%。所制備雙靶脂質體平均粒徑為142.1nm，包封率為92.2%，Zeta電位為4.4mV，證明TAT肽的正電荷被成功掩蔽。透射電鏡圖（TEM）顯示，雙靶阿霉素脂質體分布均勻且呈球形。MTT實驗表明，配體FA、T

4、AT肽最佳密度分別為5%、2.5%，以此密度構建最優(yōu)雙靶脂質體FA/TAT-LP-DOX，與葉酸單靶脂質體FA-LP-DOX相比，顯著（p<0.01）提高了細胞毒性。細胞攝取實驗證實，TAT肽與FA存在協(xié)同作用，雙靶脂質體顯著地（p<0.01）提高了細胞攝取，其平均熒光強度為單靶葉酸脂質體的1.7倍，攝取速率為單靶葉酸脂質體的1.6倍。共聚焦顯微鏡及機制考察表明，雙靶脂質體通過以網(wǎng)格蛋白為主的多種途徑進入KB細胞，遞送至溶酶體，并快速釋