丙酮酸鈉在缺氧缺血腦損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用.pdf

1、本文內(nèi)容分為三部分進(jìn)行闡述：
　　第一部分丙酮酸鈉對(duì)缺氧缺血腦損傷的保護(hù)作用
　　目的：運(yùn)用新生大鼠建立體外缺糖缺氧細(xì)胞和體內(nèi)缺氧缺血腦損傷動(dòng)物模型,觀察丙酮酸鈉(Sodium Pyruvate,SP)對(duì)新生大鼠缺氧缺血腦損傷的保護(hù)作用。
　　方法：模擬缺氧缺血建立細(xì)胞模型(oxygen and glucose deprivation, OGD)和動(dòng)物模型(Hypoxia ischemia,HI)。結(jié)扎生后7天新生大鼠

2、左側(cè)頸總動(dòng)脈,暴露于8％氧氣2.5個(gè)小時(shí),構(gòu)建良好穩(wěn)定的HI動(dòng)物模型。提取新生大鼠大腦皮質(zhì)原代神經(jīng)元,體外培養(yǎng)7天,給與缺氧缺糖2.5個(gè)小時(shí),構(gòu)建 OGD細(xì)胞模型。分別在不同時(shí)間點(diǎn)給予不同濃度的SP治療。細(xì)胞試驗(yàn)分為對(duì)照組、OGD組和不同濃度 SP治療組,而動(dòng)物模型分為假手術(shù)組、模型組和不同濃度、給藥時(shí)間 SP治療組。LDH和MTT用于檢測(cè)細(xì)胞死亡和生存狀態(tài)。TTC染色、FJB染色、Cresyl Violet染色檢測(cè)缺氧缺血腦組織損傷后

3、不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元的凋亡和腦損傷程度。
　　結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)顯示,OGD后24小時(shí) SP可以逆轉(zhuǎn)大腦皮層原代神經(jīng)元 LDH釋放的增加和MTT水平的下降,且表現(xiàn)為劑量-依從性。2mM和4mM濃度效果最佳。HI后48小時(shí)腦組織 TTC染色,SP在濃度125-1000 mg/kg之間可以顯著降低 HI對(duì)未成熟腦組織的損傷,如果在 HI損傷后5分鐘腹腔注射給與 SP500 mg/kg可以獲得最大療效。和模型組相比,SP在 HI損傷后24小時(shí)顯

4、著降低左側(cè)(損傷側(cè))大腦皮層 FJ-B染色陽性神經(jīng)元。Cresyl Violet染色顯示 HI后第7天大腦冠狀位形態(tài)發(fā)現(xiàn)丙酮酸鈉可以使 HI損傷后左側(cè)存活/右側(cè)存活的大腦皮層組織和海馬組織比例分別從45.3±11.9％、39.2±8.7％升高到80±5.5％、67.3±9％。
　　結(jié)論：體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都顯示丙酮酸鈉對(duì)缺氧缺血腦損傷有神經(jīng)保護(hù)作用
　　第二部分丙酮酸鈉對(duì)缺氧缺血腦損傷遠(yuǎn)期行為學(xué)的影響
　　目的：明確丙酮酸鈉

5、(Sodium Pyruvate, SP)能否促進(jìn)新生大鼠缺氧缺血腦損傷后遠(yuǎn)期功能恢復(fù)。
　　方法：構(gòu)建缺氧缺血(Hypoxic-ischemic, HI)動(dòng)物模型,給予 SP治療。實(shí)驗(yàn)分為三組,假手術(shù)組、模型組和SP治療組。HI損傷后3周進(jìn)行足失誤試驗(yàn)(Foot Fault Test,FFT),記錄大鼠在5分鐘內(nèi)50步中右側(cè)前肢及后肢失足次數(shù),評(píng)價(jià)大鼠感覺運(yùn)動(dòng)功能。在 HI造模后8周進(jìn)行 Morris水迷宮(Morris Wat

6、er Maze,MWM)試驗(yàn)檢測(cè) SP對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。MWM試驗(yàn)包括隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)(Learning Trial)4天和第5天的空間探索試驗(yàn)(Probe Trial)及可視平臺(tái)試驗(yàn)(Cued Trial),記錄大鼠的逃避潛伏期(Latency)、原平臺(tái)象限停留時(shí)間(The Time Spent in the Platform Quadrant)及游泳速度(Velocity)。行為學(xué)試驗(yàn)后取大腦行 Cresyl Violet染

7、色觀察大腦皮層(感覺運(yùn)動(dòng)功能)和海馬(空間學(xué)習(xí)記憶能力)損傷情況。
　　結(jié)果：在 FFT中,模型組(The Vehicle-treated Group)中大鼠右側(cè)前、后肢失足次數(shù)明顯高于假手術(shù)組(Sham Group),但 SP組中失足次數(shù)明顯下降,說明 SP可促進(jìn)腦損傷后大鼠感覺運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。MWM隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)中,模型組大鼠逃避潛伏期明顯高于假手術(shù)組,而SP治療后大鼠逃避潛伏期明顯被改善?？臻g探索試驗(yàn)中,模型組大鼠在原平臺(tái)象限停

8、留時(shí)間只有假手術(shù)組的一半,而SP治療后大鼠停留時(shí)間明顯升高,且三組大鼠游泳速度無明顯差異,說明 SP可改善腦損傷后大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能。可視平臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果三組之間無差異排除了視覺障礙對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶影響。大鼠HI損傷后左側(cè)存活/右側(cè)存活的大腦皮層和海馬組織分別為51％±9.9％和28.7％±7.4％,SP治療后分別為87.2％±3.9％和77.9％±3.6％,兩者相比有顯著差異。
　　結(jié)論：SP可促進(jìn) HI損傷后大鼠感覺運(yùn)動(dòng)功能和空間

9、記憶功能的恢復(fù)
　　第三部分丙酮酸鈉在缺氧缺血腦損傷中神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的研究
　　目的：運(yùn)用OGD細(xì)胞模型和HI動(dòng)物模型,研究丙酮酸鈉對(duì)缺氧缺血腦損傷神經(jīng)保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：分別與 OGD和HI后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)、活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)、Bcl-2家族的促凋亡蛋白 Bax、凋亡信號(hào)通路蛋白 Cleav

10、ed Caspase-3和Caspase-3、存活信號(hào)通路蛋白 P-Akt和Akt表達(dá)水平的變化,并選取 OGD和HI后以上各指標(biāo)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的時(shí)間點(diǎn)給予 SP治療。細(xì)胞模型分為對(duì)照組、OGD組和SP治療組,動(dòng)物模型分為假手術(shù)組、模型組和SP治療組。
　　結(jié)果：1.與對(duì)照組對(duì)比,OGD后 ROS水平逐漸升高,呈時(shí)間依賴型,于4h開始升高有顯著差異(p<0.05),24h升至最高(OGD/Ctrl=1.5±0.03,p<0.05)。

11、SP將 OGD后24h升高的ROS降低到了接近正常的水平(p<0.05)。2.和假手術(shù)組對(duì)比,HI后 ROS水平于3h升至最高(p<0.05),后逐漸下降。SP將模型組 HI后3h升高的ROS水平降低到了接近正常的水平(p<0.05)。3.與對(duì)照組對(duì)比,OGD后 ATP水平于4h降至最低(OGD/Ctrl=0.49±0.07,p<0.05), SP將 OGD后降低的ATP水平升高了約50％(p<0.05)。4.分別于 HI后3h、16h

12、給予 SP治療,SP分別將不同時(shí)間點(diǎn)模型組中降低的ATP水平升高約50％以上(p<0.05)。5.相比于對(duì)照組,OGD后0.5h,Bax表達(dá)水平達(dá)到最高(p<0.05),24h回到基礎(chǔ)水平。SP將 OGD后0.5h升高的Bax表達(dá)基本降到了對(duì)照組水平(p<0.05)。6.HI后3h,相比于假手術(shù)組,模型組中Bax顯著升高(p<0.05),而SP治療降低了HI后升高的Bax水平(p<0.05)。7.相比于對(duì)照組,OGD后 Cleaved

13、Caspase-3表達(dá)水平于4h逐漸升高(p<0.05),24h表達(dá)水平達(dá)到最高(p<0.05)。SP將 OGD后24h升高的Bax表達(dá)水平降低約50％(p<0.05)。8.HI后24h,模型組中Cleaved Caspase-3顯著升高(p<0.01),而SP治療組中Cleaved Caspase-3水平與模型組相比降低了約50％(p<0.05)。9.相比于對(duì)照組,OGD后 P-Akt表達(dá)水平先升高,于1h表達(dá)水平達(dá)到最高(p<0.0

14、1),后逐漸下降。OGD后1h,與 OGD組對(duì)比,SP進(jìn)一步升高了P-Akt表達(dá)水平(p<0.05)。10.HI后,P-Akt表達(dá)先升高后下降,于16小時(shí)降至假手術(shù)組的一半(p<0.05)。HI后16h,與模型組對(duì)比,SP治療顯著升高 P-Akt的表達(dá)水平(p<0.05)。
　　結(jié)論：體內(nèi) HI、體外 OGD試驗(yàn)均顯示,SP可能通過改善大腦能量代謝(ATP)、降低氧化應(yīng)激水平(ROS)和阻止神經(jīng)細(xì)胞死亡程序啟動(dòng)途徑發(fā)揮缺氧缺血腦損