丙酮酸鈉改善代謝性酸中毒作用研究.pdf

1、代謝性酸中毒是一種常見的酸堿平衡紊亂，在臨床上有很高的發(fā)病率和致死率。臨床上常見的代謝性酸中毒有乳酸酸中毒、酮癥酸中毒、高氯性酸中毒、腎小管酸中毒及毒物（甲醇、乙烯及水楊酸類化合物等）引起的酸中毒等。代謝性酸中毒有很多危害，主要為影響心肌功能、心血管功能、誘發(fā)心律不齊、激發(fā)炎癥反應(yīng)等，嚴重可導(dǎo)致患者突然死亡。代謝性酸中毒針對病因治療無效后應(yīng)使用糾酸劑。目前，臨床上常用的糾酸劑為碳酸氫鈉溶液，其通過酸堿緩沖作用來改善代謝性酸中毒。但是，研

2、究表明輸注碳酸氫鈉溶液會引起細胞內(nèi)pH降低、高碳酸血癥、鈉負荷增加等副作用，而且禁用于治療通氣功能不全的代謝性酸中毒及呼吸性酸中毒。其他糾酸劑如氨丁三醇(Tris hydroxymethyl aminomethane，THAM)可能引起呼吸抑制、低血壓、低血鉀，甚至誘發(fā)心室纖顫等副作用，禁用于伴有呼吸窘迫及兒科代謝性酸中毒的救治。目前存在的糾酸劑都有其各自應(yīng)用的局限性，所以急需研發(fā)出一種同時改善細胞內(nèi)外酸中毒的糾酸劑。
　　丙酮酸

3、鈉（Sodium Pyruvate，SP）是丙酮酸的鈉鹽，在體內(nèi)以丙酮酸根離子形式存在。丙酮酸根是內(nèi)源的能量代謝底物，具有較強的抗氧化作用。研究表明，在失血性休克液體復(fù)蘇中，丙酮酸鈉與常用的生理鹽水、乳酸林格氏液等晶體液相比，可以提高失血性休克動物的生存率、保護重要器官（例如心、腦、腎、肺、肝和腸）功能，并且能夠改善失血性休克引起的乳酸酸中毒。本課題組一直致力于研究丙酮酸鈉在失血性休克液體復(fù)蘇中的保護作用，同樣發(fā)現(xiàn)丙酮酸鈉具有很好的糾酸

4、效果，提示丙酮酸鈉可能具有改善代謝性酸中毒的作用。然而，丙酮酸鈉能否研發(fā)為新型糾酸藥物尚需深入研究。
　　失血性休克產(chǎn)生乳酸酸中毒的原因為微循環(huán)障礙及氧供不足使細胞處于缺氧狀態(tài)，誘發(fā)細胞代謝紊亂，多器官功能障礙，導(dǎo)致乳酸堆積。丙酮酸鈉在恢復(fù)血流灌注和組織氧供同時，通過抗炎抗氧化作用保護器官功能，調(diào)節(jié)細胞代謝紊亂，并且其自身代謝過程中消耗氫離子。因此，丙酮酸鈉改善失血性休克引起的乳酸酸中毒的作用究竟是來自于其對酸中毒病因-失血性休克

5、的治療，還是丙酮酸鈉本身具有糾酸作用，目前尚不明確。而失血性休克復(fù)蘇模型病理生理作用復(fù)雜，不利于對其改善代謝性酸中毒作用效果的評價和機制的探討，所以需要在其他代謝性酸中毒模型中考察丙酮酸鈉的糾酸效果。
　　氯化銨誘導(dǎo)的高氯性代謝性酸中毒動物模型，是目前評價糾酸藥物的常用動物模型，在此模型中考察丙酮酸鈉的糾酸效果及作用機制有重要意義。因為丙酮酸鈉溶液具有很低的緩沖作用（丙酮酸pKa=2.49），且其自身代謝過程消耗氫離子，推測丙酮酸

6、鈉可能通過不斷堿化細胞內(nèi)液而堿化細胞外液來改善酸中毒。因此需要在細胞內(nèi)酸中毒模型中評價丙酮酸鈉的糾酸效果。
　　本研究擬采用體內(nèi)和體外實驗，研究丙酮酸鈉對代謝性酸中毒的作用效果。首先利用氯化銨誘導(dǎo)的大鼠高氯性酸中毒模型，研究三個劑量丙酮酸鈉輸注對高氯性酸中毒的作用效果，并篩選出有效的丙酮酸鈉給藥劑量。然后采用丙酸鈉誘導(dǎo)的細胞內(nèi)酸中毒模型，研究不同濃度丙酮酸鈉孵育對細胞內(nèi)酸中毒作用效果。本研究在動物水平和細胞水平評價了丙酮酸鈉改善代

7、謝性酸中毒的作用效果，以期為臨床救治代謝性酸中毒提供候選藥物。
　　一、氯化銨誘導(dǎo)高氯性酸中毒大鼠模型的建立
　　探討丙酮酸鈉對高氯性酸中毒的作用效果，需要建立高氯性酸中毒動物模型。Marta Nowik等在日常用水中添加0.28mol/L氯化銨（含0.5％蔗糖）飼喂3天建立大鼠高氯性酸中毒模型。本研究采用Marta Nowik法建立大鼠高氯性酸中毒，并對氯化銨的飼喂時間進行了優(yōu)化。實驗分為兩組，飼喂0.28mol/L氯化銨

8、（含0.5％蔗糖）為模型組(n=10)，飼喂0.5％蔗糖為對照組(n=5)。連續(xù)飼喂5天，每天分別進行稱重，并于0、3和5天分別進行眼眶靜脈取血100μl，進行pH、cHCO3-、BE、cCl-、PCO2和PO2的檢測。
　　結(jié)果表明，飼喂3天后，模型組與對照組相比，大鼠靜脈血pH、cHCO3-、BE、cCl-、PCO2和PO2無明顯變化（P＞0.05）。飼喂5天后，模型組與對照組相比，大鼠靜脈血pH、cHCO3-和BE顯著降低(

9、P＜0.01)，cCl-顯著升高(P＜0.01)，PCO2和PO2無明顯變化。同時本實驗中發(fā)現(xiàn)，飼喂氯化銨溶液5天后，大鼠體重增加值與大鼠靜脈血pH值呈正相關(guān)，并可以擬合一元直線回歸方程。說明飼喂大鼠氯化銨5天后，大鼠體重增加值越小，靜脈血pH值相對降低的越低，大鼠酸中毒的程度越重。本實驗結(jié)果提示，在制備氯化銨誘導(dǎo)的大鼠高氯性代謝性酸中毒時，可以將大鼠體重增加量作為評價大鼠機體酸堿狀況的輔助指標(biāo)。應(yīng)用此方法建立氯化銨誘導(dǎo)的大鼠中重度高氯

10、性酸中毒模型，為丙酮酸鈉藥效學(xué)評價實驗奠定基礎(chǔ)。
　　二、丙酮酸鈉改善大鼠高氯性酸中毒的作用效果
　　采用氯化銨法建立大鼠高氯性酸中毒模型，尾靜脈輸注不同劑量的丙酮酸鈉溶液2mmol/kg(SP1,n=8),4mmol/kg(SP2,n=8),6mmol/kg(SP3,n=8)。輸注2mmol/kg碳酸氫鈉溶液為陽性對照組(SB，n=8)，輸注2ml/kg生理鹽水為體積對照組(NS，n=8)。于輸注后15min(T15)、3

11、0min(T30)、60min(T60)、120min(T120)、240min(T240)各時間點眼眶靜脈取血100μl，檢測pH、cHCO3-、BE、PCO2、PO2、電解質(zhì)、血糖和血紅蛋白濃度的變化。輸注240min后，收集大鼠靜脈血進行血肌酐、血尿素氮檢測。將大鼠處死，取腎組織并進行HE染色，分析其病理變化。
　　結(jié)果表明，輸注丙酮酸鈉后，靜脈血pH均有所升高。其中，SP1組與NS組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。SP2組和SP3組比N

12、S組高且有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。SB組與NS組相比，靜脈血pH顯著升高(P＜0.05)。輸注SP后，大鼠靜脈血T15時pH值比T0時高且具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。輸注SB后，大鼠靜脈血T30時pH值比T0時高且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。SP1和SP2組在T15后，pH、cHCO3-和BE值有先降低后升高的趨勢。SP3組提高pH效果維持至240min。SB組在T30后，pH、cHCO3-和BE值有降低的趨勢，未見升高。丙

13、酮酸鈉和碳酸氫鈉輸注均可以降低由酸中毒引起的高血鈣(P＜0.05)。丙酮酸鈉和碳酸氫鈉輸注降低血液鉀離子濃度(P＜0.05)。輸注丙酮酸鈉后，大鼠靜脈血糖SP3組比SP1組高且有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。輸注240min后，各組血漿中肌酐和尿素氮水平無統(tǒng)計學(xué)差異。腎病理切片顯示丙酮酸鈉不會加重由高氯性酸中毒引起的腎損傷。
　　三、丙酮酸鈉改善細胞內(nèi)酸中毒的作用研究
　　探討丙酮酸鈉對細胞內(nèi)酸中毒作用效果，需要建立檢測細胞內(nèi)

14、pH(intracellular pH，pHi)的方法。本實驗采用BCECF-AM熒光法實時監(jiān)測細胞pHi變化。優(yōu)化了激光共聚焦顯微鏡的參數(shù)設(shè)置，確定采用雙激發(fā)光法(激發(fā)光波長分別為488nm和440nm，發(fā)射光波長為535nm)對細胞內(nèi)BCECF熒光強度進行檢測，并通過計算熒光比值R(R=F(Ex=488nm/Em=535nm)/F(Ex=440nm/Em=535nm)）的大小反應(yīng)細胞內(nèi)pH的變化情況。
　　本實驗考察了不同濃度

15、丙酸鈉(20mmol/L和30mmol/L)對EA.hy926細胞pHi的影響，篩選丙酸鈉誘導(dǎo)EA.hy926細胞內(nèi)酸中毒模型的最適濃度。結(jié)果表明，20mmol/L丙酸鈉組與對照組相比，加載2min和3.5min后R值無統(tǒng)計學(xué)差異。30mmol/L丙酸鈉組與對照組相比，加載2min和3.5min后R值顯著下降(P＜0.05)。說明30mmol/L組比20mmol/L組誘導(dǎo)細胞內(nèi)酸中毒模型穩(wěn)定。采用30mmol/L丙酸鈉溶液誘導(dǎo)EA.hy

16、926酸中毒細胞模型，通過不同濃度的丙酮酸鈉溶液共孵育，研究其對酸中毒細胞pHi作用效果。丙酮酸鈉孵育濃度分別為33mmol/L(SP1)、66 mmol/L(SP2)和100 mmol/L(SP3)。生理鹽水(NS)為陰性對照。結(jié)果表明，生理鹽水組對EA.hy926酸中毒細胞pHi無影響。丙酮酸鈉三個劑量組均能夠引起EA.hy926酸中毒細胞pHi升高。與NS組相比，SP組峰值處的細胞pHi顯著升高(P＜0.05)。
　　綜上所