神經(jīng)干細胞移植延緩失神經(jīng)肌萎過程中突觸形成及其功能的實驗研究.pdf

1、第一部分，神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)擴增,體內(nèi)移植后延緩失神經(jīng)肌萎的作用
　　目的：驗證胚胎脊髓神經(jīng)干細胞的提取、體外培養(yǎng)和增殖方法,研究神經(jīng)干細胞移植到損傷的外周神經(jīng)后,延緩失神經(jīng)肌萎的效果。
　　方法：取孕10—12天的SD大鼠,通過機械吹打法提取脊髓神經(jīng)干細胞、以無血清限定性培養(yǎng)基進行培養(yǎng),擴增及純化得到大量增生的神經(jīng)干細胞,以神經(jīng)干細胞特異性抗體Nestin進行鑒定,將神經(jīng)干細胞進行體外分化,通過特異性抗體染色檢驗其分化為神

2、經(jīng)終末細胞的能力。傳2—3代后,將擴增的神經(jīng)干細胞球分散成單細胞懸液并調(diào)整密度為10 6/ul,備用。制作脛神經(jīng)切斷,小腿三頭肌失神經(jīng)支配模型,以微量注射器移植10 6/ul×5ul干細胞懸液至切斷的脛神經(jīng)遠端;設(shè)立對照組,僅移植5ul神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液,每組各24只。分別于術(shù)后3月,5月和7月取材,每次8只,分別觀察移植神經(jīng)干細胞在體內(nèi)存活及分化成為神經(jīng)元的情況;測量三頭肌濕重及肌纖維橫截面積維持率,驗證神經(jīng)干細胞移植能否延緩失神經(jīng)支配

3、骨骼肌的萎縮及其程度。
　　結(jié)果：利用機械吹打和無血清限定性培養(yǎng)基可以得到大量的脊髓神經(jīng)干細胞,得到的神經(jīng)干細胞可以在體外大量擴增并分化為多種神經(jīng)終末細胞,證明取得的神經(jīng)干細胞活性良好;神經(jīng)干細胞移植后3、5、7月取材及免疫組化染色顯示,移植段脛神經(jīng)內(nèi)有大量存活的神經(jīng)干細胞及其分化而來的神經(jīng)元,神經(jīng)元可以合成大量的突觸素,隨著時間延長,分化而來的神經(jīng)元明顯增加;隨著時間延長,移植和對照組三頭肌濕重,肌纖維橫截面積均進行性下降,但對

4、照組下降更明顯(P〈0.05)。
　　結(jié)論：1、機械吹打及無血清限定性培養(yǎng)基適用于脊髓神經(jīng)干細胞的提取及培養(yǎng);2、神經(jīng)干細胞在損傷的外周神經(jīng)系統(tǒng)中可以長期存活并分化為神經(jīng)元;3、神經(jīng)干細胞移植到外周神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)可以延緩失神經(jīng)肌萎的程度。
　　第二部分，移植神經(jīng)干細胞與靶肌肉形成新突觸過程的實驗研究
　　目的：將體外培養(yǎng)、擴增得到的神經(jīng)干細胞移植到脛神經(jīng)切斷模型中,觀察神經(jīng)干細胞能否與失神經(jīng)支配三頭肌重新形成突觸,以及新形

5、成突觸的功能。
　　方法：采用機械吹打和無血清限定性培養(yǎng)基得到大量活性良好的神經(jīng)干細胞,建立三頭肌失神經(jīng)支配模型,按第一部分方法分成移植組和對照組,每組30只。于移植術(shù)后3,5,7月進行檢測,通過三頭肌內(nèi)突觸(神經(jīng)肌肉接頭)免疫組化染色,神經(jīng)電生理傳導(dǎo),示蹤劑順向和逆向傳導(dǎo)實驗,比較神經(jīng)干細胞移植后對突觸后膜的影響,研究神經(jīng)干細胞能否與靶肌肉形成新的突觸,以及新形成的突觸是否具有電傳導(dǎo)和物質(zhì)傳遞功能。
　　結(jié)果：3月時:移植

6、組中突觸前膜消失,突觸后膜萎縮退變,未能檢測到電傳導(dǎo),對照組中,突觸前膜消失,突觸后膜萎縮退變更加明顯,同時數(shù)量減少,無電傳導(dǎo)能力;5月時:移植組中檢測到少量不完整的新生突觸前膜,突觸后膜趨向正常,能檢測到電傳導(dǎo),對照組中突觸前膜消失,后膜碎裂明顯,無電傳導(dǎo)能力;7月時:移植組中發(fā)現(xiàn)形態(tài)上呈各個發(fā)育階段突觸前膜,但數(shù)量少于突觸后膜,而突觸后膜形態(tài)基本正常,能檢測到明顯的電傳導(dǎo)現(xiàn)象,同時順向和逆向示蹤均為陽性結(jié)果,對照組中,突觸前后膜均完

7、全消失,電生理檢測和順向逆向示蹤均為陰性結(jié)果。
　　結(jié)論:1、神經(jīng)干細胞移植到損傷的外周神經(jīng)后,可以延緩?fù)挥|后膜萎縮退變和數(shù)量減少的發(fā)生;2、移植神經(jīng)干細胞能夠與失神經(jīng)支配靶肌肉形成新的突觸聯(lián)系;3、新形成的突觸具有物質(zhì)傳遞和電傳導(dǎo)功能。
　　第三部分,宿主再生神經(jīng)軸突與移植神經(jīng)干細胞形成突觸的實驗研究
　　目的:研究神經(jīng)干細胞移植到外周神經(jīng)系統(tǒng)后,宿主再生神經(jīng)軸突與移植神經(jīng)干細胞及其分化而來細胞之間的關(guān)系。
　

8、　方法:取孕10—12天F344大鼠,提取、培養(yǎng)并純化脊髓神經(jīng)干細胞;移植3cm長的F344神經(jīng)干至GFP轉(zhuǎn)基因大鼠的遠端脛神經(jīng),同時移植10 6/ul×5ulF344神經(jīng)干細胞懸液至移植段F344神經(jīng)干中;2周后吻合宿主脛神經(jīng)近端及移植段F344神經(jīng).術(shù)后2周取材,并進行免疫熒光染色和共聚焦觀察,研究宿主再生神經(jīng)軸突能否與移植并分化而來的神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系。
　　結(jié)果:在干細胞移植后4周(神經(jīng)吻合后2周),神經(jīng)干細胞可存活并分化