周期性牽張力對鼠骨髓基質(zhì)細胞生物學特性及RANKL、M-CSF蛋白表達的影響.pdf

1、背景成骨/基質(zhì)細胞合成、分泌的轉(zhuǎn)錄因子NF-KB受體活化劑配體(receptoractivatorofNF-KBligand，RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulatingfactor，M-CSF)在促進破骨細胞生成過程中是必需的。RANKL主要表達在成骨細胞、骨髓基質(zhì)細胞以及胸腺、淋巴結(jié)和脾組織中，能促進破骨細胞的分化、成熟和活化。M-CSF是單核巨噬細胞系統(tǒng)和破骨細胞的一種生長因子，主要

2、通過促進破骨前體細胞的募集和分化發(fā)揮作用。RANKL及M-CSF均以兩種分子形式存在：分泌型(sRANKL、sM-CSF)和膜型(mRANKL、mM-CSF)。 機械應(yīng)變是調(diào)控RANKL和M-CSF合成和分泌變化的一種重要的刺激因素。骨髓基質(zhì)細胞是一種力學可興奮細胞，體外實驗已經(jīng)證明，一定范圍的機械力可以影響骨髓基質(zhì)細胞的RANKL和M-CSF表達，且表達的量與機械刺激的大小、頻率、作用時間緊密相聯(lián)。低水平的機械張力(0-250

3、strain)不足以維持骨形成，機械張力在250-2500μstrain時可為骨組織的維持提供有效的生理性的刺激。當張力超過2500μstrain時，骨組織的破壞速度大大加快，被認為是病理性刺激。目前的文獻研究局限于一定大小機械刺激影響各種骨組織細胞的蛋白合成，且力值偏大，而機械牽張力細分為生理性和病理性，以及在蛋白水平應(yīng)力如何分別調(diào)控sRANKL、mRANKL、sM-CSF、mM-CSF的表達尚未明確。 研究目的1.本實驗通過

4、一種先進的體外細胞拉伸加力裝置，對鼠骨髓基質(zhì)細胞系ST2施加生理性及病理性周期牽張力，觀察細胞受力前后細胞形態(tài)及增殖活性的變化。 2.對鼠骨髓基質(zhì)細胞系ST2分別施加生理性及病理性的周期性牽張力，觀察分泌型及膜型RANKL和M-CSF蛋白的表達變化。 材料和方法1.體外細胞加力裝置及力學刺激 細胞加力采用華中電子科技大學研制的四點彎曲細胞力學加載儀。將ST2接種到特制的塑料培養(yǎng)板上，繼續(xù)培養(yǎng)24h，培養(yǎng)板上的細胞

5、生長到80％匯合，將培養(yǎng)板放入加力皿內(nèi)，在加力裝置上進行加力。細胞所受的張力大小由彈性板的彎曲位移(mm)表示，位移越大，形變越大，表示細胞受牽張力越大。本實驗加力頻率固定為0.5Hz，位移為1mm和2mm，即張力為1785μstrain及3570μstrain。 2.MTT法測定機械力對ST2細胞增殖的影響 細胞在特制的培養(yǎng)板上生長到對數(shù)生長期時，隨機分為3組，第1組靜置不加力，第2組加力位移1mm，第3組加力位移2m

6、m，加力時間6h。加力后細胞以2×104的密度接種于96孔板，每組接種21孔，每孔加200ul完全培養(yǎng)基。以只加完全培養(yǎng)液的孔作為空白對照組。每24h各組測定3個孔，每孔加入20ulMTT溶液(5g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)3h，吸去培養(yǎng)液，加入200ulDMSO，振蕩10min，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上以570nm測定光吸收值A(chǔ)570。 3.ELISA檢測機械力刺激下細胞培養(yǎng)液中分泌型RANKL、M-CSF的含量細胞在特制的培養(yǎng)板上生長到對數(shù)

7、生長期時，隨機分為2組，第1組加力位移1mm，第2組加力位移2mm，加力時間12h。加力過程中，分別在0h、0.5h、1h、2h、3h、6h、9h、12h等8個時間點從加力皿中各取200ul培養(yǎng)液樣品，按ELISA試劑盒的要求進行檢測。在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上以450nm測定光吸收值A(chǔ)450。 4.免疫沉淀westernblot檢測機械力刺激下膜型RANKL、M-CSF含量細胞隨機分成6組，各組的加力時間分別為0h、1h、3h、6h、

8、9h、12h，除對照組，其他各時間組以位移1mm及2mm分別進行力學加載并各自重復3次。加力后的細胞每塊塑料板加100uL的裂解液冰浴裂解。20min后，13000r/min、4℃離心10min，取上清分裝備用。每份樣品取2uL用作Bradford法做蛋白定量。每份樣品取200ug加入1uL的RANKL抗體，4℃靜置1h，后加入免疫沉淀IgG抗體200uL，4℃搖晃混旋過夜，PBS2500g離心清洗取沉淀。配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電

9、泳、轉(zhuǎn)膜、一抗二抗反應(yīng)后曝光，膠片掃描后用光密度分析軟件測定蛋白質(zhì)條帶光密度值。 結(jié)果1.MTT結(jié)果：對照組的細胞增殖穩(wěn)定，細胞數(shù)量明顯較多，1mm加力組與對照組無差異，2mm加力組細胞增殖緩慢(P＜0.01)。 2.ELISA結(jié)果：1mm牽張力作用下，細胞表達sRANKL、sM-CSF蛋白表達組間無差異，2mm牽張力作用下，sRANKL表達從3h開始表達增多(P＜0.05)，12h時差異顯著(P＜0.01)。sM-CS

10、F蛋白的表達從0.5h開始上升(P＜0.05)，從9h開始顯著高于對照(P＜0.01)。 3.免疫沉淀westernblot結(jié)果：1mm牽張力作用下，6h開始mRANKL蛋白隨著時間表達減少(P＜0.05)，mM-CSF無統(tǒng)計學差異。2mm的牽張力作用下，mRANKL、mM-CSF皆無顯著差異。 結(jié)論1.細胞受病理性牽張力后功能狀態(tài)發(fā)生變化，生長增殖受到抑制。2.生理性牽張力抑制mRANKL的表達，病理性的牽張力則促進s