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幽門螺桿菌感染以及高鹽和多酚的刺激對(duì)增殖相關(guān)蛋白CIP2A表達(dá)的影響.pdf_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是革蘭氏陰性、螺桿狀的微需氧菌,可定植于胃粘膜上皮細(xì)胞,是慢性胃炎、消化道潰瘍、胃粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤及胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素,1994年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將其列為Ⅰ類致癌因子。幽門螺桿菌的某些菌株包含有一段由27-33個(gè)基因編碼的35-40 kb cag致病島(PAI)。cagA基因是cag致病島的重要組成部分之一,它編碼了幽門螺桿

2、菌的重要毒力蛋白CagA(120-140kDa)。CagA蛋白含有一段能夠發(fā)生酪氨酸磷酸化的EPIYA基序,幽門螺桿菌黏附到胃粘膜上皮細(xì)胞以后,可通過四型分泌系統(tǒng)將毒力因子CagA蛋白注入上皮細(xì)胞。在cagA-positive幽門螺桿菌菌株的感染中,細(xì)菌源性的致癌因子CagA蛋白廣泛的參與到細(xì)菌感染導(dǎo)致的胃組織損傷以及致癌的過程之中,但涉及的分子機(jī)制尚未完全明了。
   腫瘤發(fā)生的標(biāo)志之一是細(xì)胞進(jìn)入無序增殖狀態(tài),伴有一些參與到調(diào)

3、節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡、衰老的重要細(xì)胞因子的表達(dá)紊亂。新鑒定的重要原癌蛋白CIP2A能通過抑制PP2A的活性來穩(wěn)定MYC蛋白的表達(dá)并且促進(jìn)腫瘤的形成。并且,在胃癌組織中CIP2A的表達(dá)量高于相對(duì)應(yīng)的正常胃組織,其功能與胃癌細(xì)胞的增殖能力密切相關(guān)。而作為Btk酪氨酸激酶家族成員之一的BMX/Etk激酶的功能也涉及到對(duì)細(xì)胞增殖能力的促進(jìn)以及對(duì)環(huán)境刺激的適應(yīng)性調(diào)控。因此,闡明幽門螺桿菌感染和CIP2A之間的效應(yīng)關(guān)系可以幫助我

4、們更深入的理解幽門螺桿菌感染的致癌機(jī)理以及CIP2A在胃癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。
   胃癌的發(fā)生發(fā)展除了受到幽門螺桿菌的菌株特點(diǎn)影響外,還受到宿主的遺傳易感性和環(huán)境因素的影響,與胃癌高發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的環(huán)境因素之一就是高鹽飲食。在人群的流行病學(xué)研究和動(dòng)物模型中高鹽飲食和胃癌的發(fā)病率之間的關(guān)系已經(jīng)被充分證實(shí)。但是高鹽飲食是通過何種機(jī)制增強(qiáng)了人群中胃癌的發(fā)病率尚未完全明了。因此,探討高鹽對(duì)細(xì)菌誘導(dǎo)的CIP2A表達(dá)增強(qiáng)效應(yīng)可以幫助我們更深

5、入的理解高鹽飲食和幽門螺桿菌感染在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮協(xié)同作用的分子機(jī)制。而表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)作為從天然植物綠茶中提取出來的單體成分(多酚類),其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力已經(jīng)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)P?、流行病學(xué)調(diào)查、以及病例對(duì)照研究等得到充分的證實(shí)。但EGCG抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全闡明。因此,研究EGCG對(duì)細(xì)胞中CIP2A表達(dá)水平的影響可以為理解EGCG抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力的分子機(jī)制提供更多的幫助。
   胃

6、癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,中國是胃癌的高發(fā)國家,其致死率位居全球腫瘤相關(guān)致死率第二位。由于缺乏可靠的早期診斷標(biāo)志,胃癌的預(yù)后情況并不樂觀。促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的因素涉及生物致癌因素(幽門螺桿菌)和化學(xué)致癌因素(高鹽和亞硝酸鹽)的刺激;抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的因素涉及多酚類(綠茶)和維生素類的攝入。腫瘤的分子診斷與預(yù)測(cè),已成為近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。而與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的保護(hù)性和致癌性的因素是否都存在一個(gè)相同的作用靶點(diǎn)分子,至今尚未完全

7、闡明。本研究的內(nèi)容主要涉及幽門螺桿菌的感染以及環(huán)境因素中的高鹽和EGCG的刺激對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖相關(guān)蛋白CIP2A表達(dá)的影響,旨在闡明CIP2A分子作為與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的保護(hù)性和致癌性因素存在的共同作用靶點(diǎn)的依據(jù)。該課題主要研究內(nèi)容及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
   一、幽門螺桿菌的感染能夠促進(jìn)CIP2A的表達(dá)上調(diào)
   幽門螺桿菌感染胃粘膜上皮細(xì)胞后,能激活一系列的信號(hào)途徑,包括MEK/ERK途徑,β-catenin途徑,Src

8、kinase途徑,NF-κB途徑,以及p38 MAPkinase途徑。并且能夠影響細(xì)胞內(nèi)許多致癌因子的表達(dá)變化,例如影響MYC蛋白的穩(wěn)定,影響β-catenin的核轉(zhuǎn)移,以及影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1的表達(dá)。但是迄今為止,幽門螺桿菌的感染對(duì)原癌蛋白CIP2A表達(dá)的影響尚未明了。本研究通過實(shí)施幽門螺桿菌感染細(xì)胞以及CagA的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的實(shí)驗(yàn),以及應(yīng)用了激酶抑制劑來驗(yàn)證哪幾條信號(hào)通路參與了CagA誘導(dǎo)的CIP2A表達(dá)上調(diào)效

9、應(yīng),此外實(shí)施了針對(duì)CIP2A的RNA干擾實(shí)驗(yàn),以及干擾后幽門螺桿菌再次感染細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。通過western blot檢測(cè)首次在細(xì)胞系中闡明了幽門螺桿菌的感染以及細(xì)菌源性的癌蛋白CagA誘導(dǎo)細(xì)胞的癌蛋白CIP2A表達(dá)上調(diào)的效應(yīng)機(jī)理。CagA蛋白進(jìn)入細(xì)胞后,激活了Src和MEK/ERK信號(hào)途徑,并最終導(dǎo)致CIP2A的表達(dá)上調(diào)。本研究結(jié)果為深入理解幽門螺桿菌感染誘發(fā)胃癌的分子機(jī)制提供了有力的佐證。
   二、高鹽刺激能夠增強(qiáng)幽門螺桿菌感

10、染所誘導(dǎo)的CIP2A表達(dá)上調(diào)
   本論文中第一部分的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)闡明了幽門螺桿菌的感染以及細(xì)菌源性的癌蛋白CagA誘導(dǎo)CIP2A表達(dá)上調(diào)的效應(yīng)機(jī)理,為深入的理解幽門螺桿菌感染導(dǎo)致胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了線索;同時(shí),環(huán)境中高鹽因素的刺激也是胃癌高發(fā)的危險(xiǎn)因素之一,并且高鹽飲食可能作為幽門螺桿菌感染導(dǎo)致胃癌的協(xié)同刺激因素存在。為了闡明高鹽因素刺激幽門螺桿菌后對(duì)細(xì)菌的包括CagA在內(nèi)的毒力因子表達(dá)的影響,以及高鹽刺激后的幽門螺桿菌感

11、染細(xì)胞是否比普通幽門螺桿菌感染細(xì)胞具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)CIP2A表達(dá)上調(diào)的能力,我們?cè)O(shè)計(jì)了培養(yǎng)基中不同鹽濃度刺激幽門螺桿菌后檢測(cè)相關(guān)毒力基因表達(dá)量的實(shí)驗(yàn)以及高鹽刺激后的幽門螺桿菌和普通的幽門螺桿菌分別感染細(xì)胞后對(duì)CIP2A表達(dá)量影響的western blot檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明環(huán)境中高鹽因素的刺激能夠誘導(dǎo)幽門螺桿菌毒力相關(guān)基因(cagA、vacA、tlpB、tip-alpha)的表達(dá)水平上調(diào),經(jīng)高鹽刺激后毒力增強(qiáng)的細(xì)菌感染真核細(xì)胞后,可以增強(qiáng)細(xì)

12、菌感染細(xì)胞所誘導(dǎo)的癌蛋白CIP2A表達(dá)上調(diào)效應(yīng),進(jìn)而促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展;此外,通過對(duì)CIP2A分子的檢測(cè)分析有助于理解高鹽飲食和幽門螺桿菌感染在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮協(xié)同作用的分子機(jī)制。
   三、EGCG能通過抑制BMX和CIP2A來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖
   EGCG抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制涉及到眾多因子,包括:抑制癌蛋白Myc的表達(dá)、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)以及對(duì)P53和BCL-2等凋亡相關(guān)蛋白的影響等

13、。而BMX/Etk酪氨酸激酶和CIP2A屬于一類與腫瘤細(xì)胞增殖能力相關(guān)的重要細(xì)胞因子。而迄今為止,具有抗腫瘤活性的綠茶提取物EGCG和BMX激酶以及癌蛋白CIP2A之間的關(guān)系尚未實(shí)施探討。因此,研究EGCG與BMX激酶以及癌蛋白CIP2A之間的關(guān)系,以及BMX和CIP2A之間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系可以幫助我們更深入的理解EGCG在抑制腫瘤細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮作用所涉及的分子機(jī)制?;谝陨夏康?設(shè)計(jì)了相關(guān)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證EGCG作用細(xì)胞后對(duì)BMX和CIP

14、2A蛋白表達(dá)量的影響;應(yīng)用了真核表達(dá)質(zhì)粒以及siRNA干擾技術(shù)來觀察BMX和CIP2A之間的相互調(diào)控關(guān)系;此外,還進(jìn)行了克隆形成實(shí)驗(yàn)來觀察CIP2A在EGCG誘導(dǎo)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了EGCG作用于細(xì)胞后可以導(dǎo)致細(xì)胞中CIP2A和BMX的表達(dá)水平降低,發(fā)現(xiàn)了BMX可以正向調(diào)控CIP2A的表達(dá),并驗(yàn)證了EGCG發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力所可能涉及的分子機(jī)制。這就為更充分的理解EGCG抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力的分子機(jī)理提供了更

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