鉀離子通道在星斑川鰈(Platichthys stellatus)先天性免疫防御中的作用研究.pdf

1、鉀離子通道是細(xì)胞膜上僅允許鉀離子通過(guò)的一類(lèi)重要離子通道，參與機(jī)體多種生理功能的調(diào)節(jié)，在魚(yú)類(lèi)先天性免疫防御中起著十分重要的作用。KCNN2屬于小電導(dǎo)鈣激活型鉀離子通道家族，具有Ca2+高敏感性和K+選擇性等特點(diǎn)，是淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上的鉀離子通道之一。淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是生物體重要的免疫細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞受刺激被激活時(shí)，鉀離子通道通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)離子濃度和膜電位水平，參與淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的激活、呼吸爆發(fā)、細(xì)胞因子分泌和整個(gè)機(jī)體的免疫應(yīng)答。<

2、br>　　星斑川鰈（latichthys ste latus）是一種極具商業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值的比目魚(yú)，目前被認(rèn)為是繼大菱鲆(Psetta maxima)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)之后潛力巨大的養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一。水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的頻繁爆發(fā)，嚴(yán)重限制了養(yǎng)殖業(yè)在我國(guó)的健康可持續(xù)發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)鉀離子通道與機(jī)體的多種免疫功能發(fā)揮作用都有著密不可分的關(guān)系。因此，深入了解鉀離子通道在星斑川鰈先天性免疫防御機(jī)制和調(diào)控機(jī)制中的作用，對(duì)于揭示魚(yú)

3、類(lèi)免疫應(yīng)答機(jī)制、控制魚(yú)類(lèi)病害的發(fā)生、推動(dòng)星斑川鰈養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展等都有著重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　本文以星斑川鰈外周血中淋巴細(xì)胞的cDNA為模板，克隆獲得3種電壓門(mén)控型鉀離子通道基因sfKCNT1、sfKCNQ2和sfKCNQ5的核心片段，比對(duì)發(fā)現(xiàn)分別屬于電壓門(mén)控型鉀離子通道T1亞家族、電壓門(mén)控型鉀離子通道KQT2亞家族、電壓門(mén)控型鉀離子通道KQT5亞家族，而且均與深裂眶鋸雀鯛(Stegastes partitus)鉀離子通道基因

4、的同源相似性最高，依次為93％、91％、85％。使用SMART服務(wù)器對(duì)三個(gè)基因片段進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)sfKCNT1片段較短，沒(méi)有明顯的結(jié)構(gòu)域;sfKCNQ2存在6個(gè)跨膜區(qū)域和一個(gè)低復(fù)雜度區(qū);sfKCNQ5存在一個(gè)低復(fù)雜度區(qū)。由于電壓門(mén)控型鉀離子通道具有高度的保守性，沒(méi)有獲得鉀離子通道基因的序列全長(zhǎng)，但是證實(shí)了在星斑川鰈中存在電壓門(mén)控型鉀離子通道，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　利用qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)LPS刺激淋巴細(xì)胞可

5、以促進(jìn)KCNN2基因在mRNA水平的表達(dá)，且在不同時(shí)間的變化趨勢(shì)與腹腔注射LPS后該基因在血液中變化的結(jié)果一致。LPS、PMA和滅活鰻弧菌刺激中性粒細(xì)胞使得KCNN2基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)，其中LPS的作用最顯著。在中性粒細(xì)胞中，通道激活劑和阻斷劑對(duì)KCNN2的表達(dá)均具有不同程度的抑制作用。這表明KCNN2基因參與了星斑川鰈淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
　　使用PMA、CyPPA+PMA和Apamin+PMA刺激體外培養(yǎng)的

6、中性粒細(xì)胞，測(cè)定呼吸爆發(fā)活性發(fā)現(xiàn)PMA對(duì)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性的影響具有時(shí)效性，即在刺激2h內(nèi)表現(xiàn)為促進(jìn)作用，之后表現(xiàn)為抑制作用。CyPPA和Apamin激活和阻斷KCNN2通道后，對(duì)中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活性均具有抑制作用。LPS和Apamin對(duì)淋巴細(xì)胞分泌的IL-1β和TNF-α有一定的促進(jìn)和抑制作用。LPS、CyPPA+LPS和Apamin+LPS刺激中性粒細(xì)胞，ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS促進(jìn)中性粒細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α和MP

7、O，CyPPA和Apamin均可以降低由LPS刺激引起的三者濃度的增加，且CyPPA降低的程度比Apamin小。以上結(jié)果說(shuō)明鉀離子通道KCNN2在星斑川鰈的先天性免疫防御中具有重要作用。
　　本文的研究發(fā)現(xiàn)通道在LPS刺激下被激活，誘發(fā)了一系列免疫反應(yīng)，且變化趨勢(shì)基本一致，只是細(xì)胞因子的反應(yīng)時(shí)間相對(duì)滯后，但這也符合基本的核酸蛋白變化規(guī)律。加入通道激活劑后由LPS介導(dǎo)的KCNN2基因的表達(dá)、呼吸爆發(fā)和細(xì)胞因子的分泌活動(dòng)等均受到抑制，