鉀離子通道在星斑川鰈(Platichthys stellatus)先天性免疫防御中的作用研究.pdf

1、鉀離子通道是細胞膜上僅允許鉀離子通過的一類重要離子通道，參與機體多種生理功能的調(diào)節(jié)，在魚類先天性免疫防御中起著十分重要的作用。KCNN2屬于小電導鈣激活型鉀離子通道家族，具有Ca2+高敏感性和K+選擇性等特點，是淋巴細胞和中性粒細胞上的鉀離子通道之一。淋巴細胞和中性粒細胞是生物體重要的免疫細胞，當細胞受刺激被激活時，鉀離子通道通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)離子濃度和膜電位水平，參與淋巴細胞和中性粒細胞的激活、呼吸爆發(fā)、細胞因子分泌和整個機體的免疫應答。<

2、br>　　星斑川鰈（latichthys ste latus）是一種極具商業(yè)開發(fā)價值的比目魚，目前被認為是繼大菱鲆(Psetta maxima)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)之后潛力巨大的養(yǎng)殖魚類之一。水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的頻繁爆發(fā)，嚴重限制了養(yǎng)殖業(yè)在我國的健康可持續(xù)發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)鉀離子通道與機體的多種免疫功能發(fā)揮作用都有著密不可分的關系。因此，深入了解鉀離子通道在星斑川鰈先天性免疫防御機制和調(diào)控機制中的作用，對于揭示魚

3、類免疫應答機制、控制魚類病害的發(fā)生、推動星斑川鰈養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展等都有著重要的理論和現(xiàn)實意義。
　　本文以星斑川鰈外周血中淋巴細胞的cDNA為模板，克隆獲得3種電壓門控型鉀離子通道基因sfKCNT1、sfKCNQ2和sfKCNQ5的核心片段，比對發(fā)現(xiàn)分別屬于電壓門控型鉀離子通道T1亞家族、電壓門控型鉀離子通道KQT2亞家族、電壓門控型鉀離子通道KQT5亞家族，而且均與深裂眶鋸雀鯛(Stegastes partitus)鉀離子通道基因

4、的同源相似性最高，依次為93％、91％、85％。使用SMART服務器對三個基因片段進行結(jié)構(gòu)域預測，發(fā)現(xiàn)sfKCNT1片段較短，沒有明顯的結(jié)構(gòu)域;sfKCNQ2存在6個跨膜區(qū)域和一個低復雜度區(qū);sfKCNQ5存在一個低復雜度區(qū)。由于電壓門控型鉀離子通道具有高度的保守性，沒有獲得鉀離子通道基因的序列全長，但是證實了在星斑川鰈中存在電壓門控型鉀離子通道，為后續(xù)實驗的功能研究奠定了基礎。
　　利用qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)LPS刺激淋巴細胞可

5、以促進KCNN2基因在mRNA水平的表達，且在不同時間的變化趨勢與腹腔注射LPS后該基因在血液中變化的結(jié)果一致。LPS、PMA和滅活鰻弧菌刺激中性粒細胞使得KCNN2基因的表達量均顯著上調(diào)，其中LPS的作用最顯著。在中性粒細胞中，通道激活劑和阻斷劑對KCNN2的表達均具有不同程度的抑制作用。這表明KCNN2基因參與了星斑川鰈淋巴細胞和中性粒細胞的免疫應答反應。
　　使用PMA、CyPPA+PMA和Apamin+PMA刺激體外培養(yǎng)的

6、中性粒細胞，測定呼吸爆發(fā)活性發(fā)現(xiàn)PMA對中性粒細胞呼吸爆發(fā)活性的影響具有時效性，即在刺激2h內(nèi)表現(xiàn)為促進作用，之后表現(xiàn)為抑制作用。CyPPA和Apamin激活和阻斷KCNN2通道后，對中性粒細胞的呼吸爆發(fā)活性均具有抑制作用。LPS和Apamin對淋巴細胞分泌的IL-1β和TNF-α有一定的促進和抑制作用。LPS、CyPPA+LPS和Apamin+LPS刺激中性粒細胞，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)LPS促進中性粒細胞分泌IL-1β、TNF-α和MP

7、O，CyPPA和Apamin均可以降低由LPS刺激引起的三者濃度的增加，且CyPPA降低的程度比Apamin小。以上結(jié)果說明鉀離子通道KCNN2在星斑川鰈的先天性免疫防御中具有重要作用。
　　本文的研究發(fā)現(xiàn)通道在LPS刺激下被激活，誘發(fā)了一系列免疫反應，且變化趨勢基本一致，只是細胞因子的反應時間相對滯后，但這也符合基本的核酸蛋白變化規(guī)律。加入通道激活劑后由LPS介導的KCNN2基因的表達、呼吸爆發(fā)和細胞因子的分泌活動等均受到抑制，