老年心力衰竭患者外周血淋巴細(xì)胞β-,2--AR mRNA的定量檢測.pdf

1、研究背景：心力衰竭是一組臨床上極為常見的心血管綜合征，是多數(shù)器質(zhì)性心臟病病人幾乎不可避免的結(jié)局。心臟病人一旦出現(xiàn)心力衰竭，三年的死亡率約為60％。心力衰竭迄今仍是公共衛(wèi)生重大問題，嚴(yán)重危害心臟病人的身心健康。在中國，心血管疾病已成為年齡40歲以上男性和女性的主要死亡原因，并且隨著老齡化社會的到來，其發(fā)病率呈明顯上升的趨勢。一旦患有心臟病就應(yīng)警惕心力衰竭的發(fā)生?，F(xiàn)在使用的心力衰竭早期診斷的檢查不是屬創(chuàng)傷性就是不宜對老年性患者使用；因此，當(dāng)

2、前亟待解決的關(guān)鍵問題之一是如何尋找更先進(jìn)的手段進(jìn)行心力衰竭的早期診斷。 腎上腺素受體(AdrenergicReceptor，AR)介導(dǎo)的兒茶酚胺(Catecholamines，CAs)效應(yīng)，在心血管功能調(diào)節(jié)中起著最為重要的作用。研究表明心肌β1-AR密度可能是心力衰竭(特別是早期心力衰竭)有價值的診斷指標(biāo)。但由于測定心肌β1-AR必須行心肌活檢或借助PET等昂貴儀器方可進(jìn)行，嚴(yán)重制約了研究的開展。近來研究表明外周血淋巴細(xì)胞β2-

3、AR密度的變化能動態(tài)反映心肌β1-AR密度的變化，且兩者的相關(guān)性良好。淋巴細(xì)胞β2-AR作為間接反映心肌β1-AR的指標(biāo)在臨床科研上被廣泛應(yīng)用。外周血淋巴細(xì)胞β2-AR密度的測定主要采用放射性配基方法，該方法須使用核素，對人體及環(huán)境均有害；而且該法存在非特異性結(jié)合等問題，需要尋找更新的檢測手段。 實(shí)時熒光定量PCR(FQ-PCR)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)。與傳統(tǒng)的PCR相比，實(shí)時FQ-PCR更加快

4、速、靈敏，并能有效地減少實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生污染的危險。目前實(shí)時FQ-PCR技術(shù)已在醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域尤其在病原檢測和基因表達(dá)方面得到廣泛的應(yīng)用。 本研究中，我們構(gòu)建了含β2-ARcDNA的質(zhì)粒，并以β2-ARcDNA的質(zhì)粒為參考標(biāo)準(zhǔn)，建立了實(shí)時FQ-PCR技術(shù)定量檢測β2-ARmRNA的檢測方法。同時以外周血淋巴細(xì)胞為研究模型，分別觀察心功能正常和臨床期心力衰竭老年病人β2-ARmRNA含量的變化，并與常用的心功能指標(biāo)心臟射血分?jǐn)?shù)

5、(EF)相比較，明確其作為心力衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)之可能性。若有可能，這將對心力衰竭診斷尤其是心力衰竭早期診斷具有重要的意義。 研究目的1.建立實(shí)時FQ-PCR檢測淋巴細(xì)胞β2-ARmRNA的方法并檢驗(yàn)其可靠性。 2.用實(shí)時FQ-PCR法測定心功能正常及臨床期心力衰竭病人外周血淋巴細(xì)胞β2-ARmRNA。 3.觀察淋巴細(xì)胞β2-ARmRNA含量與心功能分級及心臟射血分?jǐn)?shù)(EF)相關(guān)性，評價淋巴細(xì)胞β2-ARmRNA對心力

6、衰竭的診斷價值。 研究方法：1.樣本收集：抽取20例心功能正常病人和45例臨床期心力衰竭病人外周血10ml，分離收集淋巴細(xì)胞，計數(shù)后置-70℃凍存。 2.用SPECT對上述病人進(jìn)行心臟功能測定，計算出其EF。 3.構(gòu)建含β2-ARcDNA的質(zhì)粒，建立實(shí)時FQ-PCR檢測β2-ARmRNA的方法。 4.樣本處理：同一批PCR擴(kuò)增的樣本，先提取總RNA，再將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用建立的實(shí)時FQ-PC

7、R法對cDNA進(jìn)行定量。 5.數(shù)據(jù)分析：根據(jù)檢測結(jié)果，評價β2-ARmRNA含量與心功能分級和EF的相關(guān)性。 研究結(jié)果：1.構(gòu)建了含β2-ARcDNA的質(zhì)粒。 2.建立了實(shí)時FQ-PCR檢測β2-ARmRNA的方法：模板濃度與可檢測到的熒光信號的循環(huán)閾值(Ct)呈負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)r為-1.00。 3.心力衰竭患者淋巴細(xì)胞β2-ARmRNA含量為3567.91±3212.03cps/106cell，EF(

8、％)為36.07±8.96，與心功能正常病人淋巴細(xì)胞β2-ARmRNA含量(34973.30±15658.31cps/106cell)和EF(％)(62.20±4.96)相比較，兩者均顯著降低(p＜0.01)。 4.心衰患者心功能愈差，β2-ARmRNA含量降低愈明顯，EF降低愈顯著(p＜0.05)。 5.所有標(biāo)本的β2-ARmRNA含量與EF顯著正相關(guān)(r=0.879，p＜0.01)，心力衰竭患者β2-ARmRNA含量