載ATM反義寡核苷酸納米粒對小鼠頭頸鱗癌放射增敏基因治療的實驗研究.pdf

1、目的：(1)探討PLGA材料制備的納米粒(nanoparticle，NP)載體導入ATM反義寡核苷酸在小鼠頭頸鱗癌基因治療中的可行性，期望為頭頸腫瘤基因治療中載體的選擇提供一個新的研究思路；(2)通過體內及體外實驗探討阻斷ATM基因表達對小鼠頭頸鱗癌放射增敏作用的機理，期望為頭頸鱗癌的特異性放射增敏基因治療的研究開辟一條新途徑。 方法：(1)以PLGA為材料，采用W/O/W雙乳化溶劑蒸發(fā)法制備載ATM反義寡核苷酸NP(ATM-A

2、SODN-NP)、載ATM正義寡核苷酸NP(ATM-SODN-NP)及空白NP，檢測其理化性質，確定穩(wěn)定的制備工藝流程；(2)載ATM寡核苷酸納米粒轉染SCCⅦ細胞株，應用熒光顯微鏡和流式細胞儀觀察分析NP轉染細胞的情況；通過實時熒光定量PCR檢測體外轉染后ATM基因mRNA表達水平，以Western Blot方法檢測轉染后ATM蛋白表達水平；(3)轉染細胞后，聯合直線加速器放射治療，應用細胞克隆試驗和MTT試驗了解細胞的放射敏感性，通

3、過流式細胞儀檢測不同干預組細胞周期分布和凋亡情況；(4)C3H/He小鼠口底接種SCCⅦ細胞，構建小鼠頭頸鱗癌移植瘤模型；(5)腫瘤內注射載ATM寡核苷酸納米粒進行干預，通過HE染色觀察移植瘤組織病理特性，免疫組化分析ATM蛋白表達水平；(6)移植瘤內基因干預與放射治療相結合，通過觀察腫瘤生長抑制情況以及Tunel染色法分析腫瘤細胞凋亡情況，了解SCCⅦ移植瘤放射敏感性的改變。 結果：(1)獲得了制備載寡核苷酸納米粒工藝流程，P

4、LGA納米粒平均粒徑為116±25.2nm，PDI小于0.15，載寡核苷酸納米粒包封率為47.45％，與裸寡核苷酸相比具有抗核酸酶能力；(2)ATM-ASODN-NP體外轉染SCCⅦ細胞抑制ATM基因mRNA和ATM蛋白表達效率較對照組增高(p<0.05)；(3)細胞克隆試驗顯示ATM-ASODN-NP轉染SCCⅦ細胞與放療聯合降低了腫瘤細胞克隆形成能力，MTT試驗顯示細胞生長被抑制(p<0.05)；(4)流式細胞學技術檢測結果發(fā)現AT

5、M-ASODN-NP轉染SCCⅦ細胞與放療聯合，G2/M期阻滯受抑制，細胞凋亡率增加(p<0.05)；(5)C3H/He小鼠口底構建的SCCⅦ細胞移植瘤具有頭頸腫瘤的生物學特性，免疫組化分析顯示瘤內注射ATM-ASODN-NP組ATM蛋白表達降低(p<0.05)；(6)腫瘤內基因干預與放射治療相結合，ATM-ASODN-NP組腫瘤生長抑制率增加，Tunel染色法顯示ATM-ASODN-NP組腫瘤細胞凋亡率增高(p<0.05)。

6、結論：(1)載寡核苷酸納米粒制備工藝流程穩(wěn)定可靠，作為基因治療細胞轉染載體具有可行性；(2)轉染ATM-ASODN-NP的SCCⅦ細胞ATM基因mRNA及ATM蛋白表達下調，與放射治療聯合抑制了SCCⅦ細胞生長，促進細胞凋亡，提高了放射敏感性；(3)構建的C3H/He小鼠口底SCCⅦ細胞移植瘤具備頭頸腫瘤組織病理和生物學特性，瘤內注射ATM-ASODN-NP降低了ATM蛋白的表達，與放射治療聯合抑制了腫瘤的生長，細胞凋亡率升高，放射敏感