載ATM反義寡核苷酸納米粒對小鼠頭頸鱗癌放射增敏基因治療的實驗研究.pdf

1、目的：(1)探討PLGA材料制備的納米粒(nanoparticle，NP)載體導(dǎo)入ATM反義寡核苷酸在小鼠頭頸鱗癌基因治療中的可行性，期望為頭頸腫瘤基因治療中載體的選擇提供一個新的研究思路；(2)通過體內(nèi)及體外實驗探討阻斷ATM基因表達(dá)對小鼠頭頸鱗癌放射增敏作用的機(jī)理，期望為頭頸鱗癌的特異性放射增敏基因治療的研究開辟一條新途徑。 方法：(1)以PLGA為材料，采用W/O/W雙乳化溶劑蒸發(fā)法制備載ATM反義寡核苷酸NP(ATM-A

2、SODN-NP)、載ATM正義寡核苷酸NP(ATM-SODN-NP)及空白NP，檢測其理化性質(zhì)，確定穩(wěn)定的制備工藝流程；(2)載ATM寡核苷酸納米粒轉(zhuǎn)染SCCⅦ細(xì)胞株，應(yīng)用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察分析NP轉(zhuǎn)染細(xì)胞的情況；通過實時熒光定量PCR檢測體外轉(zhuǎn)染后ATM基因mRNA表達(dá)水平，以Western Blot方法檢測轉(zhuǎn)染后ATM蛋白表達(dá)水平；(3)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，聯(lián)合直線加速器放射治療，應(yīng)用細(xì)胞克隆試驗和MTT試驗了解細(xì)胞的放射敏感性，通

3、過流式細(xì)胞儀檢測不同干預(yù)組細(xì)胞周期分布和凋亡情況；(4)C3H/He小鼠口底接種SCCⅦ細(xì)胞，構(gòu)建小鼠頭頸鱗癌移植瘤模型；(5)腫瘤內(nèi)注射載ATM寡核苷酸納米粒進(jìn)行干預(yù)，通過HE染色觀察移植瘤組織病理特性，免疫組化分析ATM蛋白表達(dá)水平；(6)移植瘤內(nèi)基因干預(yù)與放射治療相結(jié)合，通過觀察腫瘤生長抑制情況以及Tunel染色法分析腫瘤細(xì)胞凋亡情況，了解SCCⅦ移植瘤放射敏感性的改變。 結(jié)果：(1)獲得了制備載寡核苷酸納米粒工藝流程，P

4、LGA納米粒平均粒徑為116±25.2nm，PDI小于0.15，載寡核苷酸納米粒包封率為47.45％，與裸寡核苷酸相比具有抗核酸酶能力；(2)ATM-ASODN-NP體外轉(zhuǎn)染SCCⅦ細(xì)胞抑制ATM基因mRNA和ATM蛋白表達(dá)效率較對照組增高(p<0.05)；(3)細(xì)胞克隆試驗顯示ATM-ASODN-NP轉(zhuǎn)染SCCⅦ細(xì)胞與放療聯(lián)合降低了腫瘤細(xì)胞克隆形成能力，MTT試驗顯示細(xì)胞生長被抑制(p<0.05)；(4)流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)AT

5、M-ASODN-NP轉(zhuǎn)染SCCⅦ細(xì)胞與放療聯(lián)合，G2/M期阻滯受抑制，細(xì)胞凋亡率增加(p<0.05)；(5)C3H/He小鼠口底構(gòu)建的SCCⅦ細(xì)胞移植瘤具有頭頸腫瘤的生物學(xué)特性，免疫組化分析顯示瘤內(nèi)注射ATM-ASODN-NP組ATM蛋白表達(dá)降低(p<0.05)；(6)腫瘤內(nèi)基因干預(yù)與放射治療相結(jié)合，ATM-ASODN-NP組腫瘤生長抑制率增加，Tunel染色法顯示ATM-ASODN-NP組腫瘤細(xì)胞凋亡率增高(p<0.05)。

6、結(jié)論：(1)載寡核苷酸納米粒制備工藝流程穩(wěn)定可靠，作為基因治療細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體具有可行性；(2)轉(zhuǎn)染ATM-ASODN-NP的SCCⅦ細(xì)胞ATM基因mRNA及ATM蛋白表達(dá)下調(diào)，與放射治療聯(lián)合抑制了SCCⅦ細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高了放射敏感性；(3)構(gòu)建的C3H/He小鼠口底SCCⅦ細(xì)胞移植瘤具備頭頸腫瘤組織病理和生物學(xué)特性，瘤內(nèi)注射ATM-ASODN-NP降低了ATM蛋白的表達(dá)，與放射治療聯(lián)合抑制了腫瘤的生長，細(xì)胞凋亡率升高，放射敏感