三日齡大鼠缺氧缺血腦損傷與神經(jīng)功能障礙的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分三日齡大鼠缺氧缺血腦損傷后髓鞘化障礙與遠(yuǎn)期認(rèn)知缺陷的關(guān)系
　　目的：腦室周圍白質(zhì)損傷是早產(chǎn)兒主要形式的腦損傷，導(dǎo)致腦癱與認(rèn)知功能障礙等嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。但是早產(chǎn)兒腦損傷導(dǎo)致的髓鞘化障礙與遠(yuǎn)期認(rèn)知缺陷的關(guān)系，目前國內(nèi)外研究較少。本研究采用三日齡大鼠缺氧缺血(Hypoxia-ischemia，HI)腦損傷模型，評價(jià)HI后早期和晚期兩個(gè)不同階段星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增生對少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘化的影響；并進(jìn)一步通過Morris水迷

2、宮實(shí)驗(yàn)，評估少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘化與遠(yuǎn)期認(rèn)知障礙的關(guān)系。
　　方法：三日齡SD大鼠右側(cè)頸總動脈結(jié)扎，然后置于37℃環(huán)境中，6％氧氣(其余為氮?dú)?，缺氧2.5h。對照組既不結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，也不缺氧。①HI組與正常組大鼠(n=8只)，于HI后72h(早期階段)后進(jìn)行O4、膠質(zhì)纖維相關(guān)蛋白(glialfibrillaryacidicProtein，GFAP)、CD68免疫組化染色，觀察少突膠質(zhì)前體細(xì)胞表達(dá)與星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞增生的關(guān)

3、系。②P42的HI組(n=23只)與正常組(n=24只)大鼠，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評價(jià)認(rèn)知功能。⑧P47的HI組(n=15只)與正常組(n=11只)大鼠，進(jìn)行焦油紫染色，評估神經(jīng)病理學(xué)變化。④HI組與正常組大鼠(n=8只)，于HI后44天(晚期階段)進(jìn)行髓鞘堿性蛋白(myelinbasicprotein，MBP)、2’，3’-環(huán)腺苷酸-3’-磷酸二酯酶(2’，3’-cyclicnucleotide3’-phosp-hodieste

4、rase，CNPase)染色，評價(jià)少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟程度；同時(shí)分別進(jìn)行GFAP和CD68染色，分別標(biāo)記膠質(zhì)增生和小膠質(zhì)細(xì)胞變化情況，觀察晚期階段它們對少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟的影響。
　　結(jié)果：①HI后72h，損傷側(cè)白質(zhì)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯高于對照側(cè)與正常對照組(P<0.05)。②P42進(jìn)行的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HI組大鼠學(xué)習(xí)能力明顯下降，有較長的逃跑潛伏期與游泳距離；空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)

5、果顯示，HI組大鼠記憶能力明顯下降，有較少的目標(biāo)站臺穿越次數(shù)與較低的目標(biāo)象限停留時(shí)間比例。③P47大鼠神經(jīng)病理結(jié)果顯示，HI組損傷側(cè)腦體積比率與胼胝體體積比率均明顯減少(P<0.05)。④P47大鼠腦組織MBP、CNPase免疫組化結(jié)果顯示，HI組大鼠損傷側(cè)白質(zhì)MBP陽性面積與少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目均明顯減少(P<0.05)，同時(shí)損傷側(cè)白質(zhì)區(qū)有GFAP陽性的膠質(zhì)瘢痕形成，明顯高于對照側(cè)與正常對照組(P<0.05)，而CD68陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)

6、目在三者之間無明顯差別。
　　結(jié)論：①HI后72h，大量增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞是影響少突膠質(zhì)髓鞘化的早期因素。②HI后44天，持續(xù)存在的膠質(zhì)瘢痕是影響少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘化的晚期因素。③HI造成遠(yuǎn)期的空間認(rèn)知功能障礙。④少突膠質(zhì)髓鞘化障礙是影響遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙的重要機(jī)理之一。
　　第二部分三日齡大鼠缺氧缺血腦損傷后TRAIL及其受體的表達(dá)與神經(jīng)功能障礙的研究
　　目的：早產(chǎn)兒腦損傷是引起患兒傷殘的重要原因。最近研究

7、表明，早產(chǎn)兒腦室周圍白質(zhì)損傷同時(shí)伴有灰質(zhì)神經(jīng)元/軸突的病變，并且炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦損傷的重要機(jī)理之一。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand，TRAIL)與其死亡受體(deathreceptor，DR)、誘騙受體(decayreceptor，DcR)受體結(jié)合，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種炎性反應(yīng)性疾病，但是在早產(chǎn)兒腦損傷中尚見報(bào)道；本研究采用三日齡大鼠

8、HI腦損傷模型，評估皮層TRAIL及其受體表達(dá)及相關(guān)的神經(jīng)行為功能改變情況。
　　方法：①三日齡SD大鼠右側(cè)頸總動脈結(jié)扎，然后置于37℃環(huán)境中，6％氧氣(其余為氮?dú)?，缺氧2.5h。對照組既不結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，也不缺氧。②HI后24h(急性期)，HI組與正常對照組(n=8只)分別利用免疫組化染色及免疫熒光雙標(biāo)、Westernblot、Real-timePCR等方法，從細(xì)胞水平、蛋白水平、基因水平觀察TRAIL及其死亡受體DR5、C

9、aspase-3等表達(dá)變化。③HI后7天(恢復(fù)期)，HI組與正常對照組(n=8只)分別進(jìn)行利用NeuN免疫組化染色，觀察神經(jīng)元的表達(dá)。④HI后7天(恢復(fù)期)，HI組與正常對照組(n=6只)，分別進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，觀察腦組織病理學(xué)變化。⑤HI組(n=15只)與正常對照組(n=11只)分別于HI后24h、72h、5天、7天進(jìn)行早期神經(jīng)行為評估(步態(tài)反射、翻正反射、懸崖回避、負(fù)向趨地反射)；觀察各組大鼠首次睜眼時(shí)間以評估神經(jīng)發(fā)育情況；各組

10、大鼠于P60進(jìn)行T-迷宮自主交替實(shí)驗(yàn)，評價(jià)遠(yuǎn)期認(rèn)知功能。
　　結(jié)果：①HI后24h，免疫組化結(jié)果顯示損傷側(cè)皮層表達(dá)大量的TRAIL、死亡受體DR5、誘騙受體DcR1、DcR2陽性細(xì)胞，數(shù)目明顯高于對照側(cè)和正常對照組(P<0.05)。并且損傷側(cè)皮層TRAIL/CD68雙陽性細(xì)胞數(shù)目明顯高于對照側(cè)。②Westernblot結(jié)果顯示損傷側(cè)皮層大量表達(dá)TRAIL、DR5蛋白(P<0.01)；Real-timePCR結(jié)果也顯示損傷側(cè)皮層大量

11、表達(dá)TRAIL、DR5、Caspase-3mRNA(P<0.01)。③HI后7天，免疫組化顯示損傷側(cè)皮層神經(jīng)元數(shù)目減少、結(jié)構(gòu)異常、排列紊亂。④HI后7天，HE染色顯示損傷側(cè)神經(jīng)細(xì)胞固縮、細(xì)胞走向紊亂、結(jié)構(gòu)欠清晰。⑤早期神經(jīng)行為結(jié)果顯示，HI組大鼠步態(tài)反射時(shí)間、翻正反射時(shí)間、懸崖回避反射時(shí)間、負(fù)向趨地反射時(shí)間均明顯延遲(P<0.05)；其次，HI組大鼠損傷側(cè)眼睛睜開時(shí)間明顯延遲，長于對照側(cè)和正常對照組(P<0.05)。T-迷宮自主交替實(shí)驗(yàn)