淋病流行特征及淋球菌耐藥性研究.pdf

1、第一部分：淋病患者流行病學(xué)特征分析及淋球菌分離株的耐藥性監(jiān)測(cè) 一、探討目前淋病流行特征及病人就醫(yī)行為的特點(diǎn)。在上海地區(qū)選擇3所性病專科醫(yī)院或門診，對(duì)門診病例中確診為淋病者進(jìn)行流行病學(xué)問卷調(diào)查。結(jié)果顯示，淋病門診病例中以男性居多(87．5％)，年齡分布以20歲～、30歲～、40歲～三組為主(93．8％)，職業(yè)分布居前三位者為工人、民工、干部，占全部病例的65．1％，傳播途徑以非婚性接觸為主要傳播方式(76．3％)；對(duì)性行為及疾病情

2、況分析發(fā)現(xiàn)堅(jiān)持使用安全套者占18．7％，出現(xiàn)淋病癥狀后仍有性生活者占28．8％；對(duì)就醫(yī)行為分析表明，出現(xiàn)淋病臨床相關(guān)癥狀后3天內(nèi)就診者占32．5％，有17．5％的病例愿意選擇私人診所或者不正規(guī)治療，同時(shí)發(fā)現(xiàn)20．1％的病人兩周內(nèi)曾有抗生素使用史。從調(diào)查結(jié)果可以看出，淋病在上海地區(qū)仍然主要是以非婚性接觸為主要傳播途徑；調(diào)查對(duì)象的性行為及疾病求醫(yī)行為需要引導(dǎo)和促進(jìn)，在出現(xiàn)淋病相關(guān)癥狀后仍有無(wú)保護(hù)的性行為發(fā)生，以及一些病人曾有使用抗生素史，存

3、在著傳播淋病的潛在危險(xiǎn)，也容易促進(jìn)行耐藥菌株的產(chǎn)生及流行。 二、為了解淋球菌臨床分離株對(duì)抗生素的耐藥性，我們采用瓊脂平皿稀釋法測(cè)定青霉素、頭孢曲松、四環(huán)素、多西環(huán)素、氧氟沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星、阿奇霉素和壯觀霉素對(duì)淋球菌的最低抑菌濃度(MIC)，用紙片酸度法對(duì)菌株作β一內(nèi)酰胺酶測(cè)定。并根據(jù)檢測(cè)的耐藥性結(jié)果對(duì)菌株和抗生素進(jìn)行了聚類分析。結(jié)果表明，所檢測(cè)的80株菌株中，所有菌株均對(duì)頭孢曲松和壯觀霉素敏感：其中87．5％對(duì)青霉素耐藥

4、，88．7％對(duì)四環(huán)素耐藥，產(chǎn)青霉素酶的淋球菌(PPNG)和高水平耐四環(huán)素的淋球菌(TRNG)分別占45％和18．8％；對(duì)阿奇霉素的耐藥率為94．7％；對(duì)氧氟沙星、洛美沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為97．5％，95．0％和95．O％。依據(jù)耐藥性監(jiān)測(cè)的結(jié)果分別進(jìn)行Q聚類和R聚類，可進(jìn)一步將菌株分成四類，將抗生素分成三類，為研究耐藥性與基因分型的聯(lián)系打下基礎(chǔ)，由耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果可以看出，淋球菌臨床分離株的耐藥性非常嚴(yán)重，對(duì)淋球菌的耐藥性進(jìn)行連續(xù)性

5、監(jiān)測(cè)是淋病預(yù)防控制中必不可少的步驟。 第二部分淋球菌基因分型及淋球菌耐藥性關(guān)系的研究 一、建立并優(yōu)化隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)對(duì)淋球菌進(jìn)行基因分型的方法，探索運(yùn)用RAPD進(jìn)行傳染源追蹤的可行性。采用四種不同的預(yù)處理方法提取淋球菌基因組DNA，按照擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行優(yōu)劣比較：運(yùn)用RAPD對(duì)淋球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行區(qū)分及對(duì)經(jīng)性伴傳播的淋病病例進(jìn)行RAPD指紋圖譜比較。結(jié)果表明運(yùn)用十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)法可以抽提較完整

6、的基因組DNA，獲得良好的RAPD指紋圖譜；各菌株的RAPD指紋圖譜間有明顯DNA多態(tài)性；臨床經(jīng)性伴傳播的病例中獲得了相似的RAPD指紋。研究表明，如果選擇最佳的DNA抽提技術(shù)、合適的隨機(jī)引物，運(yùn)用RAPD指紋圖譜可以對(duì)淋球菌進(jìn)行有效基因分型，并可作為分子流行病學(xué)對(duì)傳染源的追蹤的一種輔助手段。 二、了解上海地區(qū)淋病病原體奈瑟氏雙球菌的不同基因分型及各基因型與耐藥性之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。我們?cè)诮⒘薘APD基因分型的基礎(chǔ)上，運(yùn)用RAPD

7、技術(shù)對(duì)80株淋球菌臨床分離株進(jìn)行了區(qū)分，從分子水平對(duì)淋球菌進(jìn)行基因分型，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合淋球菌耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果探討不同的基因分型與耐藥性之間的關(guān)系。結(jié)果顯示80株淋球菌分離株有著較為相似的RAPD指紋圖譜，但各菌株的指紋圖譜之間有一定的多態(tài)性，依據(jù)指紋圖譜的多態(tài)性可將菌株區(qū)分為I、II、III三種基因分型，對(duì)此三種基因分型與A、B、C、D四種不同的耐藥類型進(jìn)行對(duì)應(yīng)分析，發(fā)現(xiàn)耐藥類型與基因型別之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。通過本研究發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)淋球菌流

8、行株有著不同的耐藥特點(diǎn)及基因型別，耐藥性與不同的基因分型之間存在著一定相關(guān)性(×2=27．59，P

9、b和4．2kb質(zhì)粒檢出率較高，分別為75．O％和96．3％。質(zhì)粒譜型有10種，其中以42．5kb+39．5kb+7．4kb+4．2kb、39．5kb+7．4kb+4．2kb、7．4kb+4．2kb及4．2kb四種類型居多，占86．25％。所有檢測(cè)出的PPNG菌株(包括PPNG／TRNG)均含有7．4kb質(zhì)粒，而所有TRNG菌株(包括PPNG/TRNG)則均含有42．5kb質(zhì)粒和39．5kb質(zhì)粒；而非PPNG或TRNG中所攜帶的質(zhì)粒譜型則

10、相對(duì)復(fù)雜。從而初步認(rèn)為，淋球菌臨床分離株所攜帶的4．2kb的質(zhì)粒，在大部分菌株中可以檢出，其在淋球菌耐藥機(jī)制中的具體意義尚不清楚，而7．4kb的質(zhì)?？赡軙?huì)介導(dǎo)淋球菌高水平的青霉素耐藥性，42．5kb及39．5kb質(zhì)?？赡芘c介導(dǎo)四環(huán)素高水平耐藥有關(guān)。 二、探討淋球菌的耐藥質(zhì)粒與淋球菌耐藥性之間的關(guān)系。我們對(duì)淋球菌耐藥株所攜帶的耐藥質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以此消除的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌，比較耐藥質(zhì)粒消除和轉(zhuǎn)化前后菌株的耐藥性變

11、化。結(jié)果表明，在亞致死濃度的十二烷基磺酸鈉(SDS)作用下，淋球菌的耐藥質(zhì)粒可以被部分消除(仍然攜帶42．5kb的質(zhì)粒)或者完全消除，且消除子在消除前后對(duì)抗生素的耐藥性會(huì)發(fā)生改變：而耐藥質(zhì)粒在不同的種屬的菌株之間可進(jìn)行傳遞，可以將淋球菌的耐藥質(zhì)粒傳遞給感受態(tài)的大腸桿菌，篩選出的轉(zhuǎn)化子分別攜帶含有tetM基因的42．5kb的四環(huán)素耐藥質(zhì)粒和攜帶含有TEM一1基因的7．4kb的青霉素耐藥質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化子可產(chǎn)生對(duì)相應(yīng)抗生素的耐藥性。 第四

12、部分淋球菌耐藥性與染色體耐藥基因的關(guān)系研究 一、探討淋球菌耐藥株gyrA與parc基因突變與淋球菌對(duì)喹諾酮類抗生素耐藥性之間的關(guān)系。結(jié)合前文瓊脂稀釋法測(cè)定淋球菌臨床分離株對(duì)行喹諾酮類抗生素敏感性的結(jié)果，運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增gyrA基因和parc基因的喹諾酮類耐藥決定區(qū)(QRDRs)，并對(duì)典型菌株的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序分析。產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示淋球菌敏感株只檢出gyrA基因Asp95單位點(diǎn)突變，中介菌株及耐藥菌株在gyrA基因均檢出有

13、Ser一91一Phe突變并伴有Asp95或者Ala92位突變，同時(shí)有6株檢出有parc基因的86、87、91位點(diǎn)突變及其它位置的無(wú)義突變。 進(jìn)一步根據(jù)喹諾酮類耐藥決定區(qū)測(cè)序的結(jié)果，我們針對(duì)不同的突變類型采用不同的擴(kuò)增引物，為所擴(kuò)增PCR產(chǎn)物在突變易發(fā)生的位置引入新的酶切位點(diǎn)，并運(yùn)用mnfI、SalI、PstI等限制性內(nèi)切酶對(duì)80株淋球菌臨床分離株的相關(guān)PCR產(chǎn)物進(jìn)行了多態(tài)性分析，綜合測(cè)序結(jié)果及RFLP分析結(jié)果可證明gyrA基因和

14、parc基因的喹諾酮類耐藥決定區(qū)(QRDRs)的突變與淋球菌對(duì)喹諾酮類抗生素的耐藥性密切相關(guān)，其中g(shù)yrA基因突變是淋球菌耐喹諾酮類抗生素的重要機(jī)制，而Ser一91一Phe更是引起對(duì)喹諾酮類耐藥非常關(guān)鍵的突變，parc基因的突變可能會(huì)對(duì)淋球菌耐喹諾酮類抗生素起促進(jìn)作用，常常伴隨gyrA基因突變同時(shí)出現(xiàn)，與gyrA基因突變共同介導(dǎo)淋球菌對(duì)喹諾酮類抗生素的高水平耐藥性。 二、探討mtr系統(tǒng)在介導(dǎo)淋球菌對(duì)阿奇霉素耐藥性中的作用，以及m

15、tr基因系統(tǒng)之間的負(fù)向調(diào)節(jié)關(guān)系。對(duì)臨床分離的淋球菌代表株mtrR基因序列及mtrR啟動(dòng)子區(qū)域回文結(jié)構(gòu)序列的突變進(jìn)行了測(cè)序分析，并運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)受mtrR基因調(diào)控的結(jié)構(gòu)基因mtrC的表達(dá)水平進(jìn)行了研究；同時(shí)結(jié)合前文對(duì)淋球菌耐藥性監(jiān)測(cè)的結(jié)果來(lái)揭示mtr系統(tǒng)和淋球菌對(duì)阿奇霉素耐藥性的可能關(guān)系，結(jié)果表明所有中介菌株及耐藥菌株均發(fā)生mtrR基因m05Y的突變，并伴隨mtrR啟動(dòng)子區(qū)域回文結(jié)構(gòu)的缺失突變；而敏感株有一株出現(xiàn)G45D的突變，

16、但mtrR啟動(dòng)子區(qū)域回文結(jié)構(gòu)均未檢測(cè)出有突變。調(diào)控基因mtrR的突變影響了結(jié)構(gòu)基因mtrC的表達(dá)，在有mtrR基因第105位密碼子突變，并伴隨mtrR啟動(dòng)子區(qū)域回文結(jié)構(gòu)缺失突變的菌株與無(wú)此兩位點(diǎn)突變菌株的mtrC基因表達(dá)有顯著差異(x‘：9．525，P

17、E有著負(fù)向調(diào)節(jié)作用，當(dāng)mtrR基因及啟動(dòng)子發(fā)生突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)基因的過度表達(dá)，進(jìn)而形成淋球菌對(duì)抗生素的耐藥性。 三、研究淋球菌青霉素耐藥性與penA及ponA基因突變的關(guān)系。分別運(yùn)用PCR—SSCP、PCR—RFLP對(duì)淋球菌penA及ponA基因進(jìn)行了分析，在所檢測(cè)的80株淋球菌臨床分離株中，所有菌株的penA基因均發(fā)生了(Asp-345,~)的插八突變，改變了其表達(dá)產(chǎn)物青霉素結(jié)合蛋白2(PBP2)對(duì)青霉素的親合力，而表現(xiàn)出對(duì)

18、青霉素不同程度的耐藥性。PonA作為編碼青霉素結(jié)合蛋白1(PBPl)的基因，通過RFLP分析檢測(cè)出有近93．7％的菌株發(fā)生了第421位氨基酸由亮氨酸變成脯氨酸(Leu421一Pro)的突變，此突變影響了青霉素結(jié)合蛋白l與青霉素的親合力。同時(shí)研究還表明所有的PPNG菌株也可同時(shí)發(fā)生penA基因的突變，除兩例ponA未突變外，絕大多數(shù)PPNG可發(fā)生ponA基因的突變。結(jié)果顯示在淋球菌流行株中染色體介導(dǎo)和質(zhì)粒介導(dǎo)兩種方式協(xié)同作用造成了淋球菌對(duì)