卵巢癌中IgG表達的臨床意義及應用RNAi技術阻斷其表達的研究.pdf

1、第一部分：卵巢癌中IgG表達的臨床意義 [目的] 目前諸多實驗結果均發(fā)現在多種惡性腫瘤細胞內存在有IL-6，IL-10，GM-CSF等細胞因子的異源性表達[1]，那么免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)在惡性腫瘤細胞內的出現就并不足以為奇。邱曉彥等研究表明[2，3，4]通過免疫組化、WesternBlot等實驗方法發(fā)現在人乳腺癌、大腸癌、肝癌、卵巢癌等多種上皮性惡性腫瘤細胞的胞漿中存在與免疫球蛋白(Ig)抗原

2、性相同、分子結構極為相似的蛋白分子，最初命名為Ig樣蛋白(Ig-like-protein)，而且進一步通過N端氨基酸測序明確了Ig樣蛋白即為傳統(tǒng)意義上的免疫球蛋白G；通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(Reversetranscription-polymerasechainreation，RT-PCR)和NorthernBlot，發(fā)現在人上皮來源的惡性腫瘤細胞內存在免疫球蛋白重鏈基因可變區(qū)基因(immunoglobulinheavychainge

3、nevariableregion，IgHV)重排結構，從而提出了“人上皮來源的惡性腫瘤細胞中存在免疫球蛋白的表達，，這一嶄新概念。然而對其定量表達與腫瘤分化、臨床病理類型之間的關系尚未見報道。本研究的目的就是分析卵巢癌組織中IgG表達與其臨床病理類型、細胞分化之間的關系，探討其臨床意義。 [方法] 1.將收集到的卵巢瘤標本(惡性30例，良性17例)制備成單細胞懸液； 2.應用淋巴細胞分離液去除組織中浸潤的淋巴細胞

4、，提純卵巢腫瘤細胞； 3.調整細胞濃度后加入細胞裂解液； 4.采用雙抗體夾心ELISA法來檢測裂解產物中IgG的含量。 [結果] 1.卵巢癌腫瘤細胞中能夠檢測到IgG的表達，而在卵巢良性腫瘤中檢測不到IgG的表達； 2.與非上皮來源的卵巢惡性腫瘤相比，上皮來源的卵巢惡性腫瘤其IgG的表達量明顯升高，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)； 3.與臨床分期早的卵巢癌相比，臨床分期晚的卵巢癌其IgG的

5、表達量無明顯升高，不具統(tǒng)計學意義(P＞0.05)； 4.與高、中分化程度的卵巢癌相比，低分化的卵巢癌其IgG的表達量明顯升高，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 [結論] 1.惡性卵巢腫瘤中IgG表達水平明顯升高，其表達量與卵巢癌病理類型相關，即上皮來源的卵巢癌中其IgG表達顯著高于非上皮來源卵巢癌； 2.上皮來源的卵巢癌中IgG表達與卵巢癌細胞的分化程度呈明顯的負相關，即IgG表達量隨分化程度的降低而升高

6、。 第二部分：運用RNAi技術抑制IgG基因表達的研究 [目的] RNAi技術是近年來新興的基因沉默技術，它能特異性抑制內源性或外源性靶基因。這項新技術在醫(yī)學領域的應用尤其突出，不僅可應用于基礎研究，還有望成為攻克腫瘤、艾滋病等新的治療方法[5]。尤其siRNA在基因治療方面將有著更為廣闊的前景。邱曉彥等不僅提出了“人上皮來源的惡性腫瘤細胞中存在免疫球蛋白的表達”這一嶄新概念，而且進一步的研究表明[6]通過反義技

7、術干擾其表達，結果發(fā)現癌細胞來源的IgG具有促進腫瘤細胞存活和生長的生物學活性。本研究旨在運用RNAi技術抑制卵巢癌細胞株SKOV3中IgHV基因的表達，并觀察對其細胞凋亡的誘導作用。探討RNAi新技術在抗腫瘤基因治療方面的應用前景以及封閉腫瘤細胞中IgHV基因作為惡性腫瘤治療靶點的可能性。 [方法] 1.根據siRNA的設計原則設計并化學合成siRNA序列，其中兩對特異性的siRNA序列，分別為siRNAl、siRNA

8、2；陰性對照siRNA序列為siRNA3；另外合成FAM標記的siRNA； 2.復蘇、培養(yǎng)培養(yǎng)卵巢癌細胞株SKOV3至對數生長期； 3.將FAM標記的siRNA轉染入卵巢癌細胞株SKOV3中，觀察轉染效果； 4.將特異性的siRNAl、siRNA2及陰性對照siRNA3通過轉染試劑導入到卵巢癌細胞株SKOV3中，空白對照組為未做任何siRNA的轉染； 5.分別應用RT-PCR和Western-Blot來檢

9、測4個組轉染后48h后IgHV重排基因mRNA和IgG蛋白的表達；同時采用流式細胞術觀察轉染48h后卵巢癌細胞株SKOV3細胞凋亡的情況。 [結果] 1.RT-PCR結果顯示特異性siRNA轉染SKOV3后，IgHV重排基因mRNA的表達明顯降低； 2.Western-Blot結果表明特異性siRNA轉染SKOV3后，IgG蛋白表達降低； 3.流式細胞術證實應用RNAi干擾IgHV表達后，誘導了卵巢癌細胞