VEGF-B與prelamin A相互作用的驗證及其功能研究.pdf

1、背景與目的： 細(xì)胞衰老是個復(fù)雜而漸進(jìn)的過程。A型核纖層蛋白前體(prelaminA)加工成熟出現(xiàn)異常則導(dǎo)致早老癥(HGPS)的出現(xiàn)，推測prelamin A的結(jié)合蛋白在細(xì)胞衰老過程中起著重要作用。人血管內(nèi)皮生長因子B(vascular endothelialgrowth factor B，VEGF-B)是一種近年來發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮生長因子家族的新成員，結(jié)構(gòu)與VEGF較為相似，并選擇性與VEGF的受體之一VEGFR-1結(jié)合。VEGF

2、-B參與血管生成，神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)，胚胎發(fā)育等生理過程也參與腫瘤發(fā)生的病理過程。本實驗室前期工作初步證明VEGF-B是一個prelamin A相互作用的蛋白，本研究進(jìn)一步通過一對一回復(fù)雜交實驗、細(xì)胞外蛋白沉降實驗(GST pull-down)和細(xì)胞內(nèi)定位等方法證明其與prelamin A在細(xì)胞內(nèi)外的相互作用，并探討該蛋白在細(xì)胞衰老中的作用。 方法： 構(gòu)建pGBKT7-PLA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入酵母菌AH109進(jìn)行自主激活報告基因和毒

3、性檢測后，再將pACT2-VEGF-B轉(zhuǎn)染到酵母AH109中進(jìn)行一對一回復(fù)雜交實驗；構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-VEGF-B和pGEX-4T-1-PLA，分別進(jìn)行VEGF-B和prelamin A的原核表達(dá)，通過GST pull-down實驗證明兩者在體外的相互作用；將構(gòu)建的pEGFP-N1-VEGF-B和pDsRed2-N1-PLA融合表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞293(HEK-293)和衰老表型的人胚腎細(xì)胞293PLA(HEK-293

4、PLA)，熒光顯微鏡下觀察VEGF-B在兩種細(xì)胞內(nèi)與prelamin A共定位情況。采用RT-PCR和Western blot等方法檢測VEGF-B在HEK-293和HEK-293PLA細(xì)胞中VEGF-B的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)情況，從而探討VEGF-B在衰老細(xì)胞中的作用。 結(jié)果： 成功構(gòu)建了pGBKT7-PLA穿梭質(zhì)粒，證實prelaminA的表達(dá)對酵母AH109沒有毒性和對報告基因沒有自主激活活性。一對一回復(fù)雜交實驗

5、證明VEGF-B和prelamin A在酵母菌內(nèi)能夠相互作用，同時GST pull-down實驗證明它們的結(jié)合在細(xì)胞外同樣發(fā)生。細(xì)胞定位結(jié)果表明VEGF-B定位在細(xì)胞核內(nèi)，并與prelamin A在HEK-293細(xì)胞核膜上共定位。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示與正常的HEK-293細(xì)胞相比，VEGF-B在HEK-293PLA細(xì)胞中mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平明顯下降。 結(jié)論： VEGF-B和prelamin