PRB與PIAS3的相互作用及其功能研究.pdf

1、孕激素是一種甾體類激素，在細胞生長、增殖功能中發(fā)揮重要作用(1)。孕激素功能的發(fā)揮主要通過激素與細胞內(nèi)特異的孕激素受體相互作用而產(chǎn)生，而孕激素受體PR主要有兩種亞型，即孕激素受體PRA和PRB。孕激素受體是一個結構相似基因家族-核受體亞家族的成員，這個家族的蛋白都是配基激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子(2)。孕激素受體這兩種亞型的不同主要在于PRB在其N端的BUS區(qū)包含一段164個氨基酸的AF3區(qū)。一般來說，PRB存在于細胞漿中，在孕激素作用下，PRB會

2、進入細胞核發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性(3)。 PR和其他核受體的轉(zhuǎn)錄活性與蛋白的轉(zhuǎn)錄后共價修飾有關，它會影響到蛋白質(zhì)的結構和蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。這些修飾包括蛋白質(zhì)的磷酸化(4)、乙?；?5)、泛素化(6)和SUMO化(7)。其中SUMO化與共價結合SUMO(smallubiquitin-likemodifierprotein)蛋白有關。一些重要的轉(zhuǎn)錄因子，比如GR、AR、P53、c-Jun和c-Myc都與SUMO-1共價結合。與泛

3、素化一樣，SUMO化有一組激活酶-E1、E2、E3酶，SUMO化修飾會引起蛋白質(zhì)亞細胞定位、穩(wěn)定性或者是基因的轉(zhuǎn)錄活性的改變(8)。 本文結果顯示，我們在用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察PRB的亞細胞定位時發(fā)現(xiàn)，在PIAS3的存在下，即使加入孕激素，也有大部分PRB并不進入細胞核。這提示在PRB與PIAS3之間可能存在某種功能上的相互作用。因此，我們在人胚胎腎細胞293T中建立了一套PRB轉(zhuǎn)錄激活熒光報告測試系統(tǒng)，檢測到P

4、IAS3對PRB轉(zhuǎn)錄激活活性有很強的抑制作用，并且這種抑制作用是孕激素依賴的。為了驗證PRB與PIAS3之間是否可以相互結合，我們將PRB與PIAS3構建到酵母表達載體上。實驗證明PRB與PIAS3在酵母細胞中可以相互結合，并且我們找出PRB與PIAS3相互作用的區(qū)域主要是PRB的DBD結構域。 為進一步確認PRB與PIAS3之間存在特異性的蛋白質(zhì)相互作用，本文進行了體外結合實驗(invitro：GSTpull-down)和體內(nèi)

5、結合實驗(invivo：IP)，并獲得了與酵母中的發(fā)現(xiàn)相一致的實驗結果。除此之外，本文還應用激光掃描共聚焦顯微鏡技術，在活細胞內(nèi)驗證了PRB和PIAS3存在特異性地相互作用。PRB的SUMO化會抑制其轉(zhuǎn)錄活性，同時PIAS蛋白質(zhì)家族的蛋白質(zhì)大多可以作為一些細胞內(nèi)靶蛋白的SUMO化E3酶，由此我們推測PIAS3對PRB轉(zhuǎn)錄活性的抑制與PRB的SUMO化有關。PRB存在多個SUMO化位點，其中第388個氨基酸是已經(jīng)證實的SUMO化主要修飾位