維持血透的腎衰患者血清HO-1血清及炎癥因子改變的相關(guān)性研究.pdf

1、背景：尿毒癥患者體內(nèi)活性氧產(chǎn)生過多和機(jī)體抗氧化功能不全所導(dǎo)致的組織氧化應(yīng)激損傷，是慢性腎衰竭的主要特征，對長期血液透析的終末期腎衰患者血管硬化起到促進(jìn)作用，反映尿毒癥患者體內(nèi)氧化應(yīng)激的生物標(biāo)記物種類繁多，目前認(rèn)為最有代表意義的氧化應(yīng)激標(biāo)記物是MDA，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道未達(dá)到血透指征的CRF患者血漿中MDA水平明顯高于健康對照組，并且隨著腎功能衰退的進(jìn)程而進(jìn)行性升高，進(jìn)行血透的CRF患者M(jìn)DA水平又明顯高于未血透者，而CRF患者血漿中的MDA水平

2、在透析過程中進(jìn)行性下降，患者血清MDA的升高同CRP以及冠狀動(dòng)脈硬化的進(jìn)展程度顯著相關(guān)，以上研究均表明腎衰患者隨著病程進(jìn)展，氧化應(yīng)激的水平呈上升趨勢；與氧化應(yīng)激相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化是影響尿毒癥患者生存質(zhì)量的主要并發(fā)癥之一，目前認(rèn)為慢性炎癥狀態(tài)與動(dòng)脈粥樣硬化同樣密切相關(guān)，許多論據(jù)支持“動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病”這一論點(diǎn)并且達(dá)成共識(shí)，其中C反應(yīng)蛋白(CRP)是慢性炎癥狀態(tài)最敏感的指標(biāo)，并且CRP水平與尿毒癥血液透析患者營養(yǎng)狀態(tài)有密切的相關(guān)

3、性，而高同型半胱氨酸血癥是引起血管疾病的一個(gè)獨(dú)立的重要的危險(xiǎn)因子，被認(rèn)為是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的因素之一；相反，HO-1作為一種最廣泛存在的抗氧化防御酶，被證實(shí)具有保護(hù)血管功能的作用，能夠抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生和保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其免于受到氧化應(yīng)激和炎癥等因素的損傷，目前國內(nèi)有關(guān)血紅素氧化酶的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究較多：通過微波照射預(yù)處理對誘導(dǎo)兔肝HO-1的實(shí)驗(yàn)研究，表明HO-1可能對肝臟缺血再灌注損傷起著重要的作用：通過轉(zhuǎn)染HO-1基因大鼠肝細(xì)胞系B

4、RL體外抗凋亡作用的研究證實(shí)HO-1表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗凋亡能力；通過離體培養(yǎng)的大鼠心臟成纖維細(xì)胞低氧預(yù)處理研究證實(shí)Ho-1mRNA被顯著誘導(dǎo)并維持在較高水平；通過研究證實(shí)梗阻性黃疸大鼠肺HO-1mRNA高表達(dá)有助于減輕梗阻性黃疸所引起的肺損害等等；通過建立容量負(fù)荷過重sD大鼠模型并給予氯沙坦治療研究發(fā)現(xiàn)HO-1在調(diào)節(jié)血壓和血管重構(gòu)方面有重要作用等等：目前臨床上關(guān)于HO-1在老年人急性心肌梗死(AMI)患者中的表達(dá)研究證實(shí)老年人AMI時(shí)HO-

5、1表達(dá)水平明顯升高；通過對血紅素氧化酶-1、2及內(nèi)皮素-1在妊娠高血壓綜合征患者胎盤組織中的表達(dá)及作用的研究提示血紅素氧化酶的表達(dá)減少可能在妊高征的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用等；而維持血透慢性腎衰患者的HO-1血清表達(dá)變化的研究尚有很多空白。 目的：本課題探討有關(guān)維持血透的腎衰患者血清中血紅素氧化酶-1(HO-1)與C反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、同型半胱氨酸(Hcy)、脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)等的血清

6、水平同對照人群的差異以及與上述指標(biāo)在血液透析前后的變化，為臨床上應(yīng)用血紅素氧化酶誘導(dǎo)劑防治腎衰患者的血管硬化等并發(fā)癥提供一定的依據(jù)。 方法：實(shí)驗(yàn)于2006年5月至6月在解放軍305醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成，選擇2006-01/2006-03在解放軍總醫(yī)院第二附屬醫(yī)院以及解放軍305醫(yī)院血液凈化中心進(jìn)行常規(guī)透析的慢性腎衰竭患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：1．患者血清肌酐等指標(biāo)符合終末期腎衰竭的診斷標(biāo)準(zhǔn)；2．患者透析時(shí)間在3個(gè)月以上，愿意接受此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)并簽

7、署知情同意書；3．無嚴(yán)重合并癥存在間共收入符合條件患者26例，男17例，女9例，年齡27～55歲，原發(fā)病病因?yàn)椋郝阅I小球腎炎12例，慢性間質(zhì)性腎炎5例，成人型多囊腎3例，高血壓病2例，糖尿病腎病l例，原因不明3例；以上病例按透析年限(3年以內(nèi)和3年以上)分為長期組和短期組，每組各13例，其中長期組男性7例，女性6例，短期組男性10例，女性3例，兩組患者性別年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。透析方式：所有患者均給予碳酸氫鹽透析，

8、透析液鈣1.5mmol/L，每周2～3次，每次4h，血管通路自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺，透析器采用聚砜膜(F6)，均不復(fù)用，上述患者在一周內(nèi)分別于血液透析前后靜脈取血，離心分出血清后于-20℃凍存；對照組：選取年齡及性別匹配的解放軍三零五醫(yī)院體檢人員24例組成，均為無心肺疾患，肝腎功能正常的人員，其中男12例，女12例，年齡24～49歲，靜脈取血、離心后血清于-20℃凍存；患者組與對照組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。取血前后采集所

9、有人員相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)，并定量檢測患者組血透前后和對照組的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：(1)應(yīng)用Canada Stressgen Bioreagents Corporation的HLimam Ho-1ELISA Kit通過ELISA方法定量測定血清Ho-1水平：具體步驟包括配制標(biāo)準(zhǔn)品、洗滌Buffer、稀釋Ho-1抗體、配制抗兔IgG HRP結(jié)合物稀釋液，準(zhǔn)備工作完成后使用Organon Teknika microwell system全自動(dòng)酶免疫分析儀

10、進(jìn)行測定(加樣品和標(biāo)準(zhǔn)品、使用洗滌緩沖液反復(fù)洗滌6次、加抗人HO-1抗體孵育后再次洗滌、加入抗兔IgG HRP結(jié)合物后洗板、然后加入TMB底物顯色液和終止液終止反應(yīng))，450nm波長下測出各管的吸光度和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各管測定結(jié)果；(2)采用France Diaclone Bioreagents Corporation的High sensitivityhuman IL-6 ELISA KIT測定血清IL-6水平，具體步驟如下：用標(biāo)準(zhǔn)

11、品稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到50pg/ml為主液，然后再用該主液稀釋到各標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)稀釋液進(jìn)行稀釋配制Control液，稀釋生物素化IL-6抗體、用蒸餾水進(jìn)行200倍稀釋洗滌緩沖液，稀釋抗生蛋白鏈霉素-HRP，使用Organon Teknika microwellsystem全自動(dòng)免疫分析儀，進(jìn)行免疫分析測定(根據(jù)標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)、空白及質(zhì)控?cái)?shù)量決定使用板條孔數(shù)、程序設(shè)定、添加生物素化的IL-6抗體并振蕩、保溫3小時(shí)、緩沖液洗板6次、將各管分別加入

12、制備的抗生物蛋白的鏈霉素化的HRP并振蕩、在室溫下保溫30分鐘、緩沖液洗板6次、每孔加入制備的基質(zhì)液TMB并保溫25分鐘、加入終止液H<,2>SO<,4>到各孔中、終止反應(yīng))，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀出實(shí)驗(yàn)結(jié)果；(3)使用BECKMAN IMMAGE免疫化學(xué)自動(dòng)分析系統(tǒng)及專用試劑盒測定血清CRP水平，大致步驟如下：按IMMAGE分析儀的要求，將樣品、質(zhì)控品和試劑分別置于固定的位置，按順序和體積由儀器自動(dòng)加入相應(yīng)的試劑(樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、CR

13、P抗體、緩沖液、稀釋液)，儀器自動(dòng)檢測出抗原抗體蛋白復(fù)合物濁度并計(jì)算出結(jié)果；(4)使用AxSYM Homocysteine assay機(jī)器及配套試劑，采用熒光偏振法(FPIA)測定血清Hcy水平，步驟如下：試劑準(zhǔn)備(含熒光標(biāo)記SAH的示蹤劑、含SAH-hydrolase磷酸鹽緩沖液、鼠抗SAH單克隆抗體、含DTT和adensine的預(yù)處理液、稀釋液、AxSYM HCY校正液、AxSYM HCY質(zhì)控液)，使用AxSYM System全自動(dòng)

14、免疫分析儀進(jìn)行分析(定標(biāo)、質(zhì)控、樣品申請、放置樣品、試劑裝載、檢查樣品的類型和完整度，檢查上機(jī)庫存和廢物量，檢查測試所需的樣品量和消耗品量是否足夠，檢查上機(jī)試幫、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、纖維杯和大瓶緩沖液的效期，所有檢查結(jié)束后開始啟動(dòng)測定并自動(dòng)讀數(shù))；(5)MDA的血清水平測定，步驟入下：試劑配制(無水乙醇、冰醋酸、試劑一：試劑盒自帶，20ml/瓶，觀察無凝塊、無懸浮物；試劑二：12ml/瓶，取一500ml試劑瓶，裝340ml蒸餾水徹底溶解；試

15、劑三：粉劑一只，先用500ml三角燒瓶將60ml蒸餾水煮沸，將粉劑倒入其中，然后再繼續(xù)加熱直至完全溶解，再加60ml冰醋酸；標(biāo)準(zhǔn)品：四乙氧醛丙烷10nmol/ml，5ml/1瓶)，使用BECKMAN Du530DNA/protein Analyzer比色計(jì)進(jìn)行測定，測試步驟(所有試劑均使用microlab500 series加樣器加樣、搖動(dòng)試管架使試管內(nèi)試劑混勻、用錫紙薄膜將全部試管覆蓋好，在每個(gè)試管上方扎幾個(gè)小孔，以便蒸汽流通，置入9

16、5℃恒溫水浴箱中保溫40分鐘、取下薄膜后離心3500轉(zhuǎn)/分鐘共15分鐘、用BECKMANDu530 DNA/protein Analyzer比色計(jì)進(jìn)行比色，λ=532nm，蒸餾水調(diào)“0”，以“0”和10nmol/ml兩點(diǎn)做標(biāo)準(zhǔn)曲線)。 結(jié)果：(I)維持血透的腎衰患者透析前血清HO-1、IL-6、CRP、Hcy水平較對照人群明顯升高，與對照組相比差別顯著(P<0.01)；(2)患者組血液透析治療前后上述部分指標(biāo)血清水平有明顯改變，

17、IL-6、Hcy血清水平明顯下降(P<0.05)：(3)長期組患者血透前后上述指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)：(4)短期組患者血透后Hcy水平低于血透前(P<0.01)，其它指標(biāo)血透前后均無顯著性差異(P>0.05)；(5)長期與短期血透組透析前上述指標(biāo)的血清水平均無顯著性差異。 結(jié)論：維持血透的腎衰患者血清HO-1與CRP、IL-6、Hcy等指標(biāo)的血清水平較對照人群均明顯升高，提示腎衰患者體內(nèi)炎癥水平、血管硬化損傷等血清水