內(nèi)生真菌稻鐮狀瓶霉基因敲除體系的構(gòu)建及六個細胞自噬基因的功能分析.pdf

1、自然界中，植物與微生物通常形成互利共生的體系，這對植物的生長和自然生態(tài)系統(tǒng)都起著非常重要的作用。內(nèi)生真菌是一類能廣泛與植物互作并與植物保持平衡狀態(tài)的一類微生物，其生活史中至少有一部分能侵入并且定殖在健康植物組織中，且不引起宿主植物發(fā)病。暗色有隔內(nèi)生真菌是內(nèi)生真菌中的一大類群，嚴格定殖在植物的根部，能夠增強植物的抗逆性和抗病能力，同時能影響植物的群落。稻鐮狀瓶霉Harpophora oryzae是從疣粒野生稻分離得到的一種典型暗色有隔內(nèi)生

2、真菌，定殖在水稻根部，能夠促進水稻的生長，并提高水稻抗生物和非生物脅迫能力。研究稻鐮狀瓶霉與水稻互作的分子機制有助于更好地利用該共生體系。
　　細胞自噬autophagy是在真核生物（從酵母到人類）中具有高度進化保守性的一類亞細胞降解途徑，研究表明該過程與許多植物病原真菌的侵染有關(guān)。本研究的創(chuàng)新點在于研究細胞自噬過程是否影響稻鐮狀瓶霉在水稻中的定殖從而影響共生體系。本研究基于稻鐮狀瓶霉基因組序列測定結(jié)果，探索適用于稻鐮狀瓶霉的基因

3、功能研究的方法，并且對六個自噬相關(guān)基因的功能做了深入的分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1)自噬相關(guān)基因的生物信息學分析
　　根據(jù)酵母和稻瘟病菌自噬相關(guān)基因的氨基酸序列，在17種真菌（包括兩種卵菌）中找到細胞自噬過程和調(diào)節(jié)自噬過程的基因的同源序列，并對它們的進化關(guān)系進行分析，著重對稻鐮狀瓶霉中自噬相關(guān)基因進行詳細鑒定和分析。
　　2)探索稻鐮狀瓶霉中基因功能研究的方法
　　使用目的基因敲除的方法來研究稻鐮狀瓶霉中的基

4、因功能，探索并優(yōu)化適合稻鐮狀瓶霉的基因敲除體系。成功獲得HoATG1、HoATG5、HoATG7、HoATG8、HoATG12和HoATG16共6個自噬相關(guān)基因的缺失突變體。
　　3)六個基因均參與稻鐮狀瓶霉的細胞自噬過程
　　六個基因的缺失突變體均對饑餓敏感，通過光學顯微鏡和透射電鏡的觀察發(fā)現(xiàn),六個基因HoATG1、HoATG5、HoATG7、HoATG8、HoATG12和HoATG16的缺失突變體在饑餓誘導的條件下菌絲液

5、泡內(nèi)無自噬小體積累，細胞自噬過程被阻斷。
　　4)稻鐮狀瓶霉中不同基因同酵母、稻瘟病菌的保守性驗證
　　稻鐮狀瓶霉中的HoATG5、HoATG8能夠回補稻瘟病菌突變體△Moatg5和△Moatg8的表型，證明兩個自噬基因與稻瘟病菌中的自噬基因具有結(jié)構(gòu)和功能上的同源性;通過酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)，稻鐮狀瓶霉中HoAtg5-HoAtg3，HoAtg5-HoAtg16, HoAtg7-HoAtg8，HoAtg7-HoAtg12，HoA

6、tg8-HoAtg1之間能發(fā)生互作，結(jié)果與酵母中一致，說明在稻鐮狀瓶霉中同樣有著保守的泛素樣蛋白結(jié)合系統(tǒng)。
　　5)自噬相關(guān)的三個基因?qū)λ竟采w系無影響
　　三個突變體△Hoatg5、△Hoatg7和△Hoatg8與水稻進行共培養(yǎng)的結(jié)果顯示，三個基因缺失突變體在促生效果上與野生型一致，說明三個基因HoATG5、HoATG7和HoATG8與水稻促生無關(guān);三個突變體在水稻根部定殖的結(jié)果顯示，三者都能夠定殖在水稻根部并且產(chǎn)生典型