Nrf2及NQO1在腎透明細(xì)胞癌中的表達及意義.pdf

1、目的:腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma)是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢，而其中60％-85％為透明細(xì)胞癌(clearcell renal cell carcinoma，ccRCC)。腎透明細(xì)胞癌惡性程度較高，容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且對放化療均不敏感[2]。因此，探討腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展機制對其診斷、治療、預(yù)后等方面具有重要價值。
　　核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2

2、-related factor，Nrf2)是CNC(cap-n-cohar，CNC)轉(zhuǎn)錄因子家族中調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，作為感受器感受氧化應(yīng)激，是細(xì)胞內(nèi)對抗氧化應(yīng)激最重要的機制。NQO1(NADPH quinine oxidoreductase)即醌氧化還原酶，是Nrf2/ARE抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)中下游表達蛋白。大量的研究表明:Nrf2/NQO1信號通路在呼吸、消化、神經(jīng)、心血管系統(tǒng)等多種器官的氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，而N

3、rf2、NQO1表達水平及其活性變化與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展均有密切關(guān)系。但Nrf2、NQO1在腎透明細(xì)胞癌中的表達目前尚無相關(guān)報道。本文主要研究Nrf2、NQO1的mRNA和蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織和對應(yīng)癌旁組織中的表達情況，探討其在腎透明細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　方法:收集2012年12月至2013年6月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科住院手術(shù)病人的腎透明細(xì)胞癌標(biāo)本52例，其中對照腎組織21例為癌旁4 cm以外腎組織（病理學(xué)已證實

4、）。患者年齡37～82歲，平均年齡56(56.13±13.98)歲。所有患者術(shù)前均未行放療、化療及其他保守治療。所有腎細(xì)胞癌病例均已經(jīng)過病理證實為腎透明細(xì)胞癌。標(biāo)本分為兩份，一份以10％福爾馬林固定，常規(guī)包埋、切片，另一份標(biāo)本收集后立即以液氮進行快速冷凍并保存在-80℃冰箱中。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)1997年Fuhrman三級分類標(biāo)準(zhǔn)進行病理分級，低級別組32例，高級別組20例;根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟2009年(AJCC，2009) TN

5、M分期標(biāo)準(zhǔn)進行臨床分期Ⅰ期15例、Ⅱ期16例、Ⅲ期14例和Ⅳ期7例。
　　1免疫組織化學(xué)方法檢測:檢測52例腎透明細(xì)胞癌及21例癌旁組織Nrf2及NQO1蛋白表達。運用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù):統(tǒng)計免疫組化染色陽性率數(shù)值，比較腎透明細(xì)胞癌組織和癌旁組織中Nrf2及NQO1蛋白的陽性表達率之間的差異，并分析與臨床分期、病理分級的關(guān)系，采用x2檢驗或Fisher確切概率法檢驗;Nrf2與NQO1相關(guān)關(guān)系采用Spearman秩相

6、關(guān)分析;認(rèn)為P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2 RT-PCR法檢測:檢測36例腎透明細(xì)胞癌及14例癌旁組織中Nrf2及NQO1 mRNA的表達。按照Trizol試劑使用說明書提取冰凍組織中的RNA，檢測其濃度及純度，用PE基因擴增儀行逆轉(zhuǎn)錄并擴增，并行瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker(DL2000)為標(biāo)準(zhǔn)片段作標(biāo)記，應(yīng)用紫外透射儀觀察并用數(shù)碼相機照相電泳后條帶，并應(yīng)用Quantity One凝膠圖象分析軟件分析目的電泳條

7、帶，參照相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶，結(jié)果以兩者的積分吸光度之比值統(tǒng)計，以(x)±s表示，應(yīng)用t檢驗行計數(shù)資料組間比較;以P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:在腎透明癌組織及其癌旁組織中均有Nrf2、NQO1蛋白表達。Nrf2蛋白在腎透明癌組織表達明顯高于癌旁組織中，兩種組織中的陽性率分別為76.9％和28.6％(x2=15.005，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;NQO1蛋白在腎透明癌組織表

8、達亦高于癌旁組織，兩種組織中的陽性表達率分別73.1％和23.8％(x2=14.999，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;Nrf2與NQO1蛋白的表達與臨床分期和病理分級呈正相關(guān)P＜0.05;同時Nrf2與NQO1在腎透明細(xì)胞癌組織中表達呈正相關(guān)(r=0.594，P＜0.05)。
　　2 RT-PCR結(jié)果:Nrf2和NQO1RT-PCR檢測結(jié)果:瓊脂糖凝膠電泳顯示:550bp為Nrf2目的條帶，488bp處為NQO1目的條帶，16

9、2bp處為內(nèi)參目的條帶。半定量分析結(jié)果顯示，腎透明癌組織中Nrf2和NQO1mRNA相對表達量分別為（0.767±0.125）和（1.025±0.148），而在癌旁組織中的相對表達量為分別為（0.299±0.025）和（0.181±0.051），即腎透明細(xì)胞癌組織中Nrf2和NQO1mRNA相對表達量顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1 Nrf2和NQO1蛋白及其mRNA在腎透明細(xì)胞癌