載5-ASA的SiO2納米粒對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠靶向性治療研究.pdf

1、目的:潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是炎癥性腸病的一種，是慢性、復(fù)發(fā)性，且發(fā)作與緩解相交替的非特異性炎癥性疾病，常累及黏膜及黏膜下層。臨床上治療UC的一線用藥是5-ASA，但由于疾病嚴(yán)重程度和病變結(jié)腸藥物濃度低，效果常常不盡如人意，因此迫切需要提高病變結(jié)腸的藥物濃度。隨著納米科技的發(fā)展，靶向傳送至病變結(jié)腸的的藥物成為可能。本研究的目的是制備具有靶向至炎癥結(jié)腸的載5-ASA的二氧化硅納米微粒(5-ASA-SiO

2、2NPs)，并觀察其治療UC小鼠模型的療效，為今后開發(fā)和應(yīng)用5-ASA納米粒給藥系統(tǒng)治療潰瘍性結(jié)腸炎奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法:首先用微乳法制備SiO2NPs，通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)進(jìn)行表征測(cè)定。再經(jīng)過(guò)一系列的修飾加工，將傳統(tǒng)藥物5-ASA嫁接到經(jīng)過(guò)修飾的SiO2NPs表層，得到產(chǎn)物5-ASA-SiO2NP。CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測(cè)5-ASA、SiO2NPs及5-ASA-SiO2NPs對(duì)人結(jié)直

3、腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)的體外細(xì)胞毒性。
　　60只8-9周齡的雄性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為6組，每組10只。葡聚糖硫酸鈉(DSS)自飲法建立急性結(jié)腸炎模型，分組及給藥情況如下:
　?、僬?duì)照組:自由飲用蒸餾水，生理鹽水日一次灌胃，共7天;
　?、诩膊∧Ｐ徒M;自由飲用5％ DSS溶液，生理鹽水日一次灌胃，共7天;
　　③正常劑量5-ASA組:自由飲用5％ DSS溶液，并予5-ASA200mg/kg日一次灌胃

4、，共7天;
　　④高劑量5-ASA組:自由飲用5％ DSS溶液，并予5-ASA400mg/kg日一次灌胃，共7天;
　　⑤SiO2NPs組:自由飲用5％ DSS溶液，并予SiO2NPs100mg/kg日一次灌胃，共7天;
　?、?-ASA-SiO2NPs組:自由飲用5％ DSS溶液，并予5-ASA-SiO2NPs100mg/kg日一次灌胃，共7天;
　　造模開始后，詳細(xì)觀察并記錄每只小鼠的一般情況及體重下降、大便

5、性狀、便血情況，按疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。造模第8天處死小鼠，取炎癥結(jié)腸進(jìn)行HE染色病理學(xué)觀察。ELISA法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性及小鼠血清中炎癥因子TNF-α，IL-6的水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time PCR)法檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸黏膜TNF-α mRNA，IL-6 mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1、5-ASA-SiO2NP的合成及載藥量
　　設(shè)計(jì)合成了粒徑約90nm的SiO2NP

6、s，對(duì)其進(jìn)行透射電鏡(TEM)表征測(cè)定，結(jié)果表明，該納米微粒大小均一，表面圓整光滑，分散性好。經(jīng)過(guò)一系列修飾后，將5-ASA嫁接到表層，得到產(chǎn)物5-ASA-SiO2NP。載藥量為13.79±2.50％。
　　2、體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)
　　在5-ASA、SiO2NPs及5-ASA-SiO2NPs濃度為1mg/ml的條件下，CCK-8法檢測(cè)Caco-2細(xì)胞存活率分別為94.16±3.31％、74.81±2.03％和84.28±1.7

7、3％。
　　3、DAI及結(jié)腸病理組織學(xué)評(píng)分
　?、倌Ｐ徒M小鼠DAI評(píng)分9.00±2.21、結(jié)腸病理組織學(xué)評(píng)分10.00±1.50，與正常組小鼠DAI評(píng)分0.10±0.32、結(jié)腸病理組織學(xué)評(píng)分0相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示UC小鼠模型制備成功;
　　②SiO2NPs組小鼠DAI評(píng)分9.33±1.66、結(jié)腸病理組織學(xué)評(píng)分9.33±1.73，與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　

8、?、壅┝?-ASA組、高劑量5-ASA組、5-ASA-SiO2NPs組DAI評(píng)分分別為6.70±1.99、5.20±2.11、4.80±1.81，結(jié)腸病理組織學(xué)評(píng)分分別為6.10±0.99、4.00±0.82、3.90±1.10，與模型組相比均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　?、芨邉┝?-ASA組及5-ASA-SiO2NPs組與正常劑量5-ASA組比較DAI及結(jié)腸病理組織學(xué)評(píng)分明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

9、＜0.05);
　?、莞邉┝?-ASA組與5-ASA-SiO2NPs組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4、結(jié)腸組織MPO活性
　?、倌Ｐ徒M小鼠結(jié)腸組織MPO活性34.52±2.22U/mg組織，與正常組MPO活性1.97±0.82U/mg組織相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　?、赟iO2NPs組MPO活性34.09±1.72U/mg組織，與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.

10、05);
　　③正常劑量5-ASA組、高劑量5-ASA組、5-ASA-SiO2NPs組MPO活性分別為25.65±1.97U/mg組織、10.26±1.30U/mg組織、10.88±1.44U/mg組織與模型組相比均不同程度降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　?、芨邉┝?-ASA組及5-ASA-SiO2NPs組結(jié)腸組織MPO活性要低于正常劑量5-ASA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　?、莞邉┝?-A

11、SA組與5-ASA-SiO2NPs組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5、血清中IL-6、TNF-α在蛋白水平的表達(dá)
　?、倌Ｐ徒M小鼠血清中IL-6在蛋白水平表達(dá)量315.78±31.12pg/ml、TNF-α表達(dá)量284.47±27.13pg/ml，與正常組IL-6表達(dá)量53.18±9.04pg/ml、TNF-α表達(dá)量42.21±7.04pg/ml相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　②

12、SiO2NPs組小鼠血清中IL-6在蛋白水平表達(dá)量317.79±18.91pg/ml、TNF-α表達(dá)量282.00±22.71pg/ml，與模型組IL-6、TNF-α表達(dá)量相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　?、壅┝?-ASA組、高劑量5-ASA組、5-ASA-SiO2NPs組血清中IL-6在蛋白水平表達(dá)量分別為226.18±17.46pg/ml、126.45±8.85pg/ml、135.07±10.92pg/ml，T

13、NF-α在蛋白水平表達(dá)量分別為153.31±17.91pg/ml、84.03±9.32pg/ml、87.49±6.99pg/ml，與模型組相比均不同程度降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　?、芨邉┝?-ASA組及5-ASA-SiO2NPs組血清中IL-6、TNF-α在蛋白水平表達(dá)量要低于正常劑量5-ASA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　?、莞邉┝?-ASA組與5-ASA-SiO2NPs組小鼠相比較，差異無(wú)

14、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　6、結(jié)腸黏膜中IL-6mRNA、TNF-α mRNA的表達(dá)
　?、倌Ｐ徒M小鼠結(jié)腸黏膜中IL-6 mRNA表達(dá)量26.11±1.64、TNF-α mRNA表達(dá)量14.99±1.55，與正常組小鼠IL-6 mRNA表達(dá)量1.11±0.27、TNF-α mRNA表達(dá)量1.07±0.25相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　?、赟iO2NPs組小鼠結(jié)腸黏膜中IL-6 mRNA表達(dá)

15、量25.52±1.65、TNF-α mRNA表達(dá)量14.67±1.29，與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　?、壅┝?-ASA組、高劑量5-ASA組、5-ASA-SiO2NPs組結(jié)腸黏膜中IL-6mRNA的表達(dá)量分別為10.32±0.98、4.63±0.67、4.73±0.50，TNF-αmRNA的表達(dá)量分別為4.73±0.90、2.02±0.48、1.83±0.39，與模型組相比均不同程度降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

16、意義(P＜0.05);
　　④高劑量5-ASA組及5-ASA-SiO2NPs組小鼠結(jié)腸黏膜IL-6 mRNA、TNF-αmRNA的表達(dá)要低于正常劑量5-ASA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　?、莞邉┝?-ASA組與5-ASA-SiO2NPs組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:1、成功制備了具有有效載藥量，安全性較高，且對(duì)UC小鼠模型炎癥結(jié)腸有較強(qiáng)靶向性的載藥納米粒5-ASA-SiO2NPs