組成型表達(dá)雞致病性大腸桿菌fimA與ompC融合蛋白的重組乳酸桿菌的構(gòu)建及其在雞腸道定殖特性的研究.pdf

1、禽大腸桿菌病(avian colibacillosios)是由禽致病性大腸埃希氏菌(APEC)感染禽類引起的多種臨床病型的總稱。主要表現(xiàn)有胚胎和幼雛的死亡、敗血癥、氣囊炎、心包炎、輸卵管炎、腸炎、腹膜炎和大腸桿菌性肉芽腫等。病原性大腸埃希氏菌(E.coli)血清型眾多，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，給防治本病帶來了困難，因此，尋求針對(duì)主要致病大腸桿菌免疫保護(hù)譜廣的抗原物質(zhì)，并模擬其自然感染的黏膜免疫，對(duì)該病的特異性免疫防治具有重要的實(shí)踐意義。
　

2、　為得到引發(fā)黏膜免疫并傳遞特異性抗原物質(zhì)的活菌載體，本實(shí)驗(yàn)從健康雞腸道分離乳酸桿菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)其對(duì)于腸道的粘附能力和耐藥性進(jìn)行了檢測(cè)。通過形態(tài)、培養(yǎng)、生化特性鑒定以及16s rRNA鑒定，共獲得了8株乳酸桿菌，其中包括3株Lactobacillus crispatus（卷曲乳桿菌）、2株Lactobacillus johnsonii（約氏乳桿菌）、2株Lactobacillus salivarius（唾液乳桿菌）和1株Lactobac

3、illus saerimneri。8株乳酸桿菌在37℃和42℃均能良好生長(zhǎng);抑菌試驗(yàn)表明，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性及陰性細(xì)菌均有一定的抑菌活性。體外粘附實(shí)驗(yàn)表明，8株乳酸桿菌均具有一定的粘附特性，可在腸道內(nèi)定殖?？股孛舾行詫?shí)驗(yàn)表明8株乳酸桿菌對(duì)多種抗生素敏感。
　　在特異性抗原物質(zhì)的制備上，選用APEC O1血清型的Ⅰ型菌毛A(FimA)和外膜蛋白C(OmpC)作為靶抗原基因片段，以APEC基因組為模板，A1和A2為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增5'端

4、帶有ApalⅠ酶切位點(diǎn)和linker序列，3'端帶有ApaⅠ酶切位點(diǎn)的528bp的基因片斷FimA。以C1、C2為引物，擴(kuò)增5'端帶有SacⅠ酶切位點(diǎn)和Flag標(biāo)簽序列，3'端帶有ApalⅠ酶切位點(diǎn)的1074bp的基因片段OmpC。再將FimA和OmpC與T載體進(jìn)行亞克隆連接構(gòu)建，獲得二者基因融合的重組質(zhì)粒pMD18-T-OmpC-fimA，構(gòu)建了Ⅰ型菌毛A(FimA)和外膜蛋白C(OmpC)的融合基因片段。
　　利用限制性內(nèi)切酶

5、SacⅠ和ApaⅠ將融合基因片段酶切后定向插入含有HCE組成型強(qiáng)啟動(dòng)子并具有錨定結(jié)構(gòu)序列(Anchor)的乳酸菌組成型表面表達(dá)載體pPG-T7g10-PPT中，并將重組質(zhì)粒pPG-T7g10-PPT-OmpC-FimA電轉(zhuǎn)化入工程菌干酪乳桿菌Lactobacillus casei393和雞腸道分離的乳酸桿菌M-11（Lactobacillus saerimneri）中，構(gòu)建獲得了兩株重組菌pPG-T7g10-PPT-OmpC-FimA/

6、L393和pPG-T7g10-PPT-OmpC-FimA/M-11。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明融合基因在兩株乳酸桿菌中均獲得了表達(dá)，出現(xiàn)了約101KDa的特異性反應(yīng)帶。重組乳酸桿菌在雞腸道內(nèi)定殖特性分析結(jié)果表明，飼喂重組菌可以使肉仔雞的日增重明顯增加，與對(duì)照組相比差異顯著;模擬腸道環(huán)境中，重組菌可耐受pH=3的酸性環(huán)境，在0.1％的膽汁酸鹽環(huán)境中可良好生長(zhǎng);重組菌可在雞腸道內(nèi)定殖，在免疫后的14天，重組菌的數(shù)量趨于穩(wěn)定，一直持