溴代阻燃劑和甲狀腺素運載蛋白相互作用的ESI-MS研究.pdf

1、溴代阻燃劑由于具有良好的阻燃性能被廣泛地應(yīng)用于各種工業(yè)品及家用產(chǎn)品中，具有一定生產(chǎn)規(guī)模的商業(yè)化的溴代阻燃劑有75種，生產(chǎn)和使用最多的只有5種，分別為四溴雙酚 A、六溴代環(huán)十二烷、十溴聯(lián)苯醚、八溴聯(lián)苯醚、五溴聯(lián)苯醚。目前，已在多種環(huán)境介質(zhì)中和生物體中發(fā)現(xiàn)多溴聯(lián)苯醚的存在，如在空氣、土壤、底泥、灰塵等室內(nèi)外環(huán)境中，鳥類、陸生生物、水生生物等生物體中均檢測到了多溴聯(lián)苯醚的存在，并且含量呈逐年上升的趨勢。多溴聯(lián)苯醚具有難降解性、遠距離傳輸、高親

2、脂性等，通過食物鏈表現(xiàn)出生物可累積性及生物放大作用，最終導(dǎo)致對生物體的毒害效應(yīng)。其中多溴聯(lián)苯醚的內(nèi)分泌干擾毒性尤其是對甲狀腺系統(tǒng)的干擾是研究的熱點和難點之一。多溴聯(lián)苯醚及其代謝物羥基化的多溴聯(lián)苯醚和生物體內(nèi)的甲狀腺素（T4）在結(jié)構(gòu)上較相似，當其在生物體內(nèi)累積到一定濃度時可能會和甲狀腺素運載蛋白（TTR）結(jié)合，占據(jù)甲狀腺素的結(jié)合位點，干擾甲狀腺素的運輸，影響甲狀腺素正常的生理功能，從而引起生物體內(nèi)甲狀腺系統(tǒng)的紊亂。四溴雙酚 A（TBBPA

3、）作為一種使用最廣泛、使用量最大的溴代阻燃劑在各種環(huán)境介質(zhì)和生物體內(nèi)已被檢測到，且濃度逐年增加，有關(guān) TBBPA毒理研究的報道越來越多，其結(jié)構(gòu)和甲狀腺素類似，也可能在累積到一定濃度時和甲狀腺素運載蛋白相互作用，干擾甲狀腺素的運輸和正常的生理功能。
　　本論文通過電噴霧質(zhì)譜法（ESI-MS）研究了生物體內(nèi)含量最高的溴代阻燃劑—BDE-47及其代謝物3-OH-BDE-47、TBBPA和TTR的相互作用，并通過體外競爭實驗研究了3-OH

4、-BDE-47、TBBPA、T4和TTR結(jié)合力的大小，此外通過滴定實驗研究了3-OH-BDE-47、TBBPA和T4的協(xié)同結(jié)合效應(yīng)。
　　首先通過 ESI-MS研究了不同質(zhì)譜參數(shù)條件（特別是離子源條件）下 TTR的電噴霧質(zhì)譜響應(yīng)信號及TTR單體和四聚體的多電荷峰分布。研究發(fā)現(xiàn)干燥氣溫度和裂解電壓對TTR的電噴霧質(zhì)譜響應(yīng)影響較大。選擇合適的干燥氣溫度或裂解電壓條件可以較好的保持 TTR蛋白質(zhì)的天然的活性結(jié)構(gòu)（即四聚體結(jié)構(gòu)）。這一部分

5、的實驗對TTR電噴霧質(zhì)譜檢測條件的探索也為以后研究 TTR和溴代阻燃劑等小分子配體的相互作用打下基礎(chǔ)。
　　在模擬生理條件下進行 BDE-47、3-OH-BDE-47、TBBPA和TTR的體外孵育實驗，通過 ESI-MS研究了BDE-47、3-OH-BDE-47、TBBPA和TTR的相互作用情況。實驗發(fā)現(xiàn) BDE-47和TTR有弱的相互作用，只得到1：1TTR/BDE-47復(fù)合物，且復(fù)合物的穩(wěn)定性較弱，增加干燥氣溫度或裂解電壓該復(fù)

6、合物很容易解離。3-OH-BDE-47和TTR有較強的結(jié)合力，不僅得到1：1TTR/3-OH-BDE-47復(fù)合物，而且在合適的條件下，也可以觀察到1：2TTR/3-OH-BDE-47復(fù)合物的存在，并且在我們的實驗條件和檢測條件下得到的TTR/3-OH-BDE-47復(fù)合物較穩(wěn)定。TBBPA也能和TTR形成1：1TTR/TBBPA、1：2TTR/TBBPA復(fù)合物且復(fù)合物較穩(wěn)定。
　　為了進一步研究3-OH-BDE-47、TBBPA、T

7、4結(jié)合 TTR能力的大小，我們開展了三種配體小分子和TTR相互作用的體外競爭實驗。將等濃度的3-OH-BDE-47、T4和TTR共同孵育并通過 ESI-MS研究可能的復(fù)合物組成，實驗結(jié)果表明，復(fù)合物主要結(jié)合的是3-OH-BDE-47，說明3-OH-BDE-47結(jié)合TTR的能力大于 T4，因此生物體內(nèi)3-OH-BDE-47濃度積累到一定濃度時將可能取代 T4而競爭結(jié)合到 TTR上，干擾 T4的正常運輸，表現(xiàn)出甲狀腺素的干擾毒性。TBBPA

8、、T4和TTR競爭結(jié)合實驗也得到類似的結(jié)論，TBBPA結(jié)合TTR的能力大于 T4，也表現(xiàn)出一定程度的內(nèi)分泌干擾毒性。通過開展了3-OH-BDE-47、TBBPA和TTR相互作用的滴定實驗，我們進一步研究了3-OH-BDE-47、TBBPA和TTR的協(xié)同結(jié)合效應(yīng)，實驗結(jié)果顯示了3-OH-BDE-47、TBBPA和TTR均有負協(xié)同效應(yīng)，即一分子的3-OH-BDE-47或TBBPA結(jié)合到 TTR上，均使蛋白不易與第二個配體分子的結(jié)合，這與 T