乙型肝炎病毒逆轉錄酶區(qū)A181T-V變異的相關研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:
   乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染呈世界性分布,盡管乙肝疫苗已經(jīng)普及了20年,但全球仍有20億人感染過HBV,其中2.4億為慢性感染。我國的慢性HBV感染者有9300萬,其中2000萬是慢性乙型肝炎患者。
   治療慢性乙型肝炎最重要的手段是控制HBV復制,以減輕和延緩病情的發(fā)展。目前主要有兩大類抗病毒藥物:干擾素和核苷(酸)類似物。由于核苷(酸)類似物服用方便,作用效果強、不良

2、反應少,已被越來越多的慢性乙型肝炎患者所接受。但在長期抗病毒治療的同時,HBV會在藥物的壓力下獲得適應性變異,產生耐藥病毒株,導致治療的失敗。臨床上輕則引起患者病情的進展,重則誘發(fā)肝硬化、肝衰竭等。因此耐藥相關的研究已受到越來越多學者的關注。
   關于核苷(酸)類似物耐藥的位點大多都集中在HBV逆轉錄酶(reversetranscriptase,RT)區(qū)的A至D結構域內。研究表明,目前能引起HBV耐藥的5條通路中有2條通路都和

3、B結構域rtA181 T/V變異相關,這是一個交叉核苷和核苷酸兩大類藥物的交叉耐藥位點,對目前幾乎所有核苷(酸)類似物均呈現(xiàn)一定的耐藥性。對rtA181T/V變異的研究有著深刻的意義。
   HBV基因組是短小而高效精干的,其中67%的基因組重疊編碼,一段序列可重復編碼1.5次。逆轉錄酶區(qū)的突變同樣可以導致表面抗原S區(qū)編碼氨基酸的改變。rtA181T變異后可引起S區(qū)氨基酸提前產生終止密碼子,而使表面抗原截短;rtA181V變異后

4、可引起表面抗原出現(xiàn)氨基酸的置換,那么這種對表面抗原的影響差異在臨床上和實驗室中是否一致?HBV在復制和傳播中同時受到宿主免疫和藥物壓力的影響。除了核苷(酸)類似物的耐藥主要發(fā)生在RT區(qū),rtA181T/V變異病毒株的C區(qū)變異情況又如何呢?
   隨著臨床可選核苷(酸)類似物的增加,耐藥變異的形式也呈現(xiàn)多樣化、復雜化。不同的多藥耐藥位點出現(xiàn)是臨床所面臨的新挑戰(zhàn),有很多針對這方面的研究,但大多是對直接測序的結果而展開。這樣并不能分清

5、不同的變異位點在同一株病毒上,還是不同的病毒株之間,因此有必要對其采用克隆后測序的方法,對宿主體內病毒準種進行詳盡的分析,了解病毒的變異特點。
   基因型可能影響病情發(fā)展和預后。我國慢性乙型肝炎患者主要是B基因型和C基因型,rtA181T/V變異在這兩種不同基因型間是否存在選擇,不同基因型的rtA181T/V變異表現(xiàn)是否一致?因此,有待對上述諸多問題進行詳盡的分析,為臨床抗病毒治療提供理論基礎。
   第一章、乙型肝炎

6、病毒逆轉錄酶區(qū)181位點變異的臨床特征分析
   目的:
   探討rtA181變異和臨床抗病毒用藥的關系,變異后患者臨床特征的變化,rtA181變異的模式,與我國B、C基因型的關系,以及A181位點不同變異之間的差異。
   方法:
   1、篩選經(jīng)核苷(酸)類似物治療產生rtA181變異的慢性乙型性肝炎患者,納入研究的85例患者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》診斷。對所有患者抗病毒治療期間

7、的相關臨床資料進行回顧,并對發(fā)生耐藥時的患者肝功能、表面抗原、e抗原、HBV DNA等指標進行檢測,通過PCR產物測序結果確定基因型。
   2、所有數(shù)據(jù)均使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析?;颊哔Y料中計數(shù)資料構成比采用R×C表的x2檢驗,定量資料采用用獨立樣本t檢驗。以P值小于0.05時有統(tǒng)計學差異。
   結果:
   1、RT區(qū)A181位點變異的主要模式有8種:A181T、A181V、A181T+N236

8、T、A181V+N236T、A181T+A181V、A181T+M204I/V±L180M±V173L、A181V+M204I/V±L180M±V173L、A181T+N236T+M204I等。84例(98.82%)患者接受過阿德福韋治療。rtA181T/V變異在阿德福韋治療組中有9例,而在拉米夫定換用阿德福韋治療組中有33例,其分布存在統(tǒng)計學顯著差異(P=0.046);rtA181T/V+rtN236T變異模式在兩組中分別為16例和1

9、1例,兩者比較亦存在顯著差異(P<0.001);而rtA181T/V+rtM204I/V變異在兩不同治療組中分布同樣存在差異(P=0.016)。
   2、與抗病毒治療前相比,盡管發(fā)生rtA181耐藥變異,患者臨床相關指標仍可能有所改善。反映肝功能的ALT由抗病毒治療前的175±130U/L下降至82±49U/L(P<0.001);反映病毒復制狀態(tài)的HBV DNA由5.97±1.26 log10copies/mL下降至4.10±

10、1.18 log10 copies/mL(P<0.001);病毒的表面抗原(HBsAg)由3.66±0.36 log10 COI下降到3.50±0.45 log10 COI(P=0.013)。但是患者HBeAg狀態(tài)在治療前后變化不大(P=0.973)。
   3、85患者中,13例(15.7%)為B基兇型,72例(84.3%)為C基因型,未見其他基因型。B基因型患者中rtA181T變異4例,rtA181V變異9例;C基因型中rt

11、A181T變異40例,rtA181V變異30例,rtA181T+rtA181V變異2例。不同變異在基因型分組中統(tǒng)計學無差異(P>0.05)。
   4、按照B、C基因型分組,兩組患者在抗病毒治療前臨床資料相近,未見統(tǒng)計學差異(P>0.05)。在出現(xiàn)耐藥時的相關臨床特征(ALT、HBsAg、HBV DNA、HBeAg等)亦沒有表現(xiàn)出明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
   5、按照rtA181T和rtA181V不同變異分組,

12、患者在抗病毒治療前的一般資料、生化指標、病毒水平、表面抗原水平、e抗原狀態(tài)等方面比較無差異(P>0.05),但在出現(xiàn)變異耐藥時,rtA181T突變組的HBsAg水平較rtA181V組低(3.40±0.351gCOI vs.3.62±0.541g COI,P=0.030)。與抗病毒前相比,rtA181T變異患者出現(xiàn)耐藥時的生化、病毒指標明顯下降(P<0.05);而rtA181V變異患者耐藥時病毒量和轉氨酶明顯改善(P<0.001),但HB

13、sAg水平似乎變化不明顯(P=0.315)。
   結論:
   1、rtA181變異主要和阿德福韋用藥有關。rtA181T/V變異在拉米夫定換用(或加用)阿德福韋的治療患者中多見;而A181T/V+N236T變異多出現(xiàn)在單用阿德福韋治療的患者中。
   2、rtA181T/V變異后病情可能不出現(xiàn)大的反彈。
   3、B、C基因型對rtA181變異無明顯影響。不同變異模式在B、C基因型中的分布無差異;不同

14、基因型患者變異后的臨床指標也相近。
   4、rtA181T變異和rtA181V變異患者在抗病毒治療前的臨床資料統(tǒng)計無差異。但在發(fā)生變異時,rtA181T變異組的HBsAg水平較rtA181V組的低。
   第二章、乙型肝炎病毒逆轉錄酶區(qū)181位點變異的病毒學特點分析
   目的:
   探討HBV rtA181變異病毒的準種特點,以及不同變異中前C區(qū)G1896A及BCP區(qū)A1762T/G1764A變異的

15、情況。
   方法:
   1、選部分標本對HBV逆轉錄酶區(qū)進行擴增,純化回收后插入pMD18T載體,轉化DH5α大腸桿菌。對每個樣本挑選18個以上的克隆進行測序,經(jīng)VectorNTI軟件進行組裝拼接,并用Chromatogram軟件比對測序峰圖,MEGA4、BioEdit軟件比對序列,分析病毒準種特點。
   2、對所有標本PCR擴增C基因區(qū)nt1623~ nt2076,產物直接測序后分析BCP、pC變異與rt

16、A181變異的關系。
   3、前C區(qū)和基本核心啟動子變異分析采用計數(shù)資料的x2檢驗。P值小于0.05時有統(tǒng)計學差異,所有統(tǒng)計學分析使用SPSS13.0軟件進行。
   結果:
   1、檢測到位于同一病毒株上的rtA181相關耐藥組合有:A181T+M204V、A181T+N236T、A181V+N236T, A181T+V173L、L180M+181V和A181T+N236T+M250L,尚未發(fā)現(xiàn)L180M+

17、181T組合耐藥變異株。
   2、rtA181T變異株在其病毒準種中所占比例為14.3%~95.2%; rtA181V變異株在病毒準種的比例為60.0%~100.0%。全部為rtA181V變異病毒準群的基因組距離和熵值相對較低??寺》治鲞€發(fā)現(xiàn)PCR直接測序不能檢測到的rtA181D和rtA181L變異。
   3、C基因核心啟動子A1762T和G1764A雙突變在rtA181T變異組的比例明顯較rtA181V變異組高(

18、P=0.009),而前C區(qū)G1896A位點突變在rtA181變異組合CHB對照組間并沒有表現(xiàn)出顯著差異(P=0.144)。
   結論:
   1、鑒定出多種同一病毒株上的rtA181T/V伴隨的組合耐藥變異形式。
   2、rtA181T變異病毒準種中?;煊幸吧筒《局?。rtA181變異除了常見的rtA181T和rtA181V變異外,還可有rtA181D和rtA181L等變異。
   3、BCP突變在r

19、tA181T變異組中出現(xiàn)比例高于rtA181V變異組,高于慢乙肝對照組。
   第三章、不同基因型1.24拷貝乙型肝炎病毒rtA181T/V突變株的構建
   目的:
   為進一步比較rtA181變異在不同基因型之間的生物學特點,構建rtA181T和rtA181V突變質粒,為下一步體外實驗提供必要的條件。
   方法:
   1、利用Mizokami教授惠贈的Ae-JPN、Ba-JPN58、C-

20、JPNAT、D-US68四株1.24拷貝HBV不同基因型的重組質粒為模板,設計錯配堿基引物,通過重疊延伸PCR的方法,獲得人工定點突變RT區(qū)相應片段,利用XbalⅠ和SphⅠ兩個單酶切位點,與野生病毒株相應序列置換,獲得不同基因型rtA181T突變和rtA181V突變病毒株。
   2、采用引物M13F和M13R對構建突變質粒進行PCR擴增鑒定;利用限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切,以及EcoRⅠ單酶切對重組質粒進行酶切

21、鑒定,初步鑒定重組突變質粒。對各基因型分別取3株rt181T突變株和rt181V突變株克隆,對插入片段DNA進行測序,確認突變質粒的正確構建。
   結果:
   構建不同基因型的rtA181T突變和rtA181V突變的pUC-HBV1.24質粒,經(jīng)PCR擴增、酶切和核苷酸序列測定結果均與預期相符;pUC-HBV1.24-181T質粒的FLLA基序氨基酸突變?yōu)镕LLT,而pUC-HBV1.24-181V質粒的相應氨基酸突

22、變?yōu)镕LLV,并且與野生型質粒相比,未引入其他突變位點。
   結論:
   經(jīng)體外突變重組,成功構建了不同基因型rtA181T/V突變的1.24拷貝的HBV全基因突變株。
   第四章、不同基因型乙型肝炎病毒逆轉錄酶區(qū)181位點變異株體外特性研究
   目的:
   比較A、B、C、D四種基因型的rtA181T和rtA181V耐藥變異病毒在體外細胞學水平上的生物學特性,為臨床抗病毒及挽救治療提供

23、理論依據(jù)。
   方法:
   1、利用OMEGA公司的Endo-Free中量質粒抽提試劑盒提取Ae-JPN、Ba-JPN58、C-JPNAT、D-US68四種野生型和rtA181T/V突變病毒質粒,以及pSEAP質粒。
   2、HepG2細胞復蘇培養(yǎng)后,按1.5×106細胞/每孔接種至6孔細胞培養(yǎng)皿中,待細胞融合度80~85%時,利用X-tremeGENE HP DNA轉染試劑按1∶3的比例,分別將pUC-H

24、BV1.24-181T或pUC-HBV1.24-181V質粒(5ug)和pSEAP報告基因質粒(0.1ug)共轉染,并設置空轉對照。轉染48~72小時后收集細胞上清進行HBsAg和HBV DNA的檢測。
   2、模擬宿主體內混合病毒株狀態(tài),將不同基因型的rtA181T突變質粒與其野生型質粒分別按0∶1、1∶0、1∶1、1∶9四種不同比例混合(轉染質??偭繛?ug),與0.1 ug pSEAP質粒共轉染HepG2細胞。轉染48~

25、72小時后測定細胞上清中HBsAg和HBV DNA水平。
   4、利用SEAP試劑盒檢測細胞上清中分泌性堿性磷酸酶(SEAP)的表達,以此平衡各組轉染效率,并以各基因型的野生型質粒為對照換算相關結果。
   5、同一基因型之間統(tǒng)計采用獨立樣本t檢驗。若方差不齊,采用Satterthwaite近似t檢驗。不同基因型之間統(tǒng)計采用單向方差分析(One-Way ANOVA)。HBVDNA在進行統(tǒng)計前先進行對數(shù)轉換。
  

26、 結果:
   1、rtA181T突變后明顯影響HBsAg的分泌,細胞培養(yǎng)上清中的HBsAg幾乎檢測不出,只有各野生型0.33%~2.22%;而rtA181V突變后影響相對較小,HBsAg水平能維持在野生型的80%以上。各基因型中rtA181T突變和rtA181V突變之間HBsAg比較均存在顯著差異(P<0.001)。
   2、rtA181T突變明顯影響HBV顆粒的合成,大部分細胞上清中檢測不到HBV顆粒,即使檢測到

27、也是較低,在102拷貝/mL水平。各基因型的rtA181T突變和rtA181V突變之間病毒顆粒的分泌均存在明顯差異。
   3、不同基因型rtA181T突變質粒的HBsAg水平比較無統(tǒng)計學差異(F=1.563,P=0.272);而不同基因型rtA181V突變質粒的HBsAg水平存在差異(F=6.261,P=0.017),A、D基因型的HBsAg水平比B基因型的水平高。
   4、rtA181V突變質粒的HBV DNA水平

28、在不同基因型間存在差異(F=25.630,P<0.01),具體表現(xiàn)為B、C基因型的DNA水平較A和D基因型的低。
   5、rtA181T突變株與野生型質粒共轉染后,HbsAg表達缺陷能夠得到部分糾正。當野生型質粒比例占10%時,細胞培養(yǎng)上清液中能檢測到少量HBsAg;當野生型質粒比例提高到50%左右,HBsAg水平能恢復高到50%左右。組間進行比較發(fā)現(xiàn):在野生質粒50%的情況下,不同基因型的HBsAg水平存在差異(F=4.79

29、9,P=0.034)。A基因型的相對活性較高、而D基因型的活性相對較低。在野生質粒10%和0的情況下,不同基因型之間HBsAg水平無明顯差異(P>0.05)。
   6、rtA181T突變株和野生株共轉染后,細胞上清中的HBV DNA表達情況也和HBsAg近似。隨著野生型質粒濃度的提高,病毒表達情況也逐漸提高,野生型質粒50%的時候,HBV DNA水平已達到40%以上。但在不同比例的混合質粒中,不同基因型之間比較均沒有統(tǒng)計學差異

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