HBV逆轉(zhuǎn)錄酶特定變異對其藥物敏感性的影響.pdf

1、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球性公共衛(wèi)生問題，核苷類似物是目前治療慢性乙肝的重要藥物，但長期使用核苷類似物易發(fā)生耐藥，耐藥己成為乙肝抗病毒治療中的重要熱點(diǎn)問題。耐藥現(xiàn)象的一個重要原因是HBV逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）發(fā)生耐藥突變，RT特定突變與耐藥有確定關(guān)系。研究HBV耐藥突變，很重要的一環(huán)是臨床病毒株的體外表型分析。由于缺乏有效的HBV體外感染模型，現(xiàn)有HBV體外表型分析主要依賴重組HBV DNA體外轉(zhuǎn)染系

2、統(tǒng)。在這種背景下，一種可支持HBV體外復(fù)制的HBV DNA重組體就顯得十分關(guān)鍵了。體外可復(fù)制的HBV DNA重組體至少需包含1.1倍以上的HBV基因組，限于HBV基因組的松弛環(huán)狀特殊結(jié)構(gòu)，及其開放讀碼框的高度重疊性，構(gòu)建體外可復(fù)制重組體殊為困難。本研究建立了一種新策略，可以用來構(gòu)建HBV1.1×基因組重組體。利用該策略，我們研究了RTS246T變異對HBV Entecavir體外敏感性的影響，以及RT N118H變異對Adefovir體

3、外敏感性的影響。
　　 目的：建立一種構(gòu)建HBV1.1×全基因組重組體的新策略，利用該策略，分析臨床樣本中含有特定變異的病毒株對核苷類藥物的體外敏感性。
　　 方法：
　　 1.以片段置換反應(yīng)（Fragment Substitution Reaction，F(xiàn)SR）為核心，建立HBV1.1×全基因組重組體構(gòu)建新策略；
　　 2.選擇一例 Entcavir治療反應(yīng)不佳的患者，分離其血清HBVDNA，構(gòu)建含有R

4、T S246T變異的HBV1.1倍體，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，進(jìn)行體外ETV藥敏分析；
　　 3.選擇三例 Adefovir治療反應(yīng)不佳的患者，分離其血清HBVDNA，構(gòu)建含有RTN118H變異的HBV1.1倍體，建立穩(wěn)定復(fù)制HBV細(xì)胞系，進(jìn)行體外ADV藥敏分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.片段置換反應(yīng)（FSR）可以有效地將DNA片段插入載體目標(biāo)位置。當(dāng)待替換片段與被替換片段同源性較高時(shí)，F(xiàn)SR高效且簡便；
　　

5、 2、利用片段置換反應(yīng)構(gòu)建的HBV1.1×全基因組重組體均可支持HBV體外復(fù)制；
　　 3.含有RT S246T變異的HBV在體外的ETV IC50為0.99±0.09nM，與野生株相比，差異不明顯；
　　 4.含有RT N118H變異的HBV在體外的ADV IC50為0.076±0.010μM，與野生株相比，無顯著差異。
　　 結(jié)論：我們成功建立了一種新的分子克隆方法，即片段置換反應(yīng)（FSR），其優(yōu)點(diǎn)是可以繞

6、過酶切連接步驟，將DNA片段插入載體。FSR方法在很多情況下（例如沒有合適的酶切位點(diǎn)時(shí)），較傳統(tǒng)酶切鏈接克隆方法更為靈活有效，由于這一特點(diǎn)，該方法在分子生物學(xué)研究方面有廣泛應(yīng)用前景?；贔SR，我們發(fā)展了一種新的體外可復(fù)制HBV1.1倍體構(gòu)建策略，該策略允許我們很方便地從患者血清樣本HBV DNA構(gòu)建HBV1.1×重組體，從而大大方便了HBV表型分析相關(guān)研究。利用該策略，我們對一例ETV部分反應(yīng)患者，及三例ADV治療反應(yīng)不佳患者血清HB