逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑膦甲酸鈉用于治療乙型肝炎病毒感染的理論與實(shí)踐.pdf

1、具有逆轉(zhuǎn)錄特征的生物酶廣泛存在于乙型肝炎病毒(HBV)、人類T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV)、鼠乳腺癌病毒(MMTV)、人類自身免疫缺陷病毒(HIV)、花椰菜花葉病毒(CaMV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)等多種動(dòng)植物病毒中，它們對(duì)人類的自身健康和生產(chǎn)生活產(chǎn)生了巨大的不良影響。針對(duì)逆向轉(zhuǎn)錄酶(RT)的藥物研究具有廣泛的重要意義。通常情況下，藥物研發(fā)過程必須要設(shè)計(jì)出適合于高通量篩選的靶位模型。傳統(tǒng)的RT活性的3H摻入檢測(cè)法由于其操作過程復(fù)雜和放射性

2、核素使用方面固有的缺陷，已不能滿足當(dāng)前的需要，而且難以發(fā)展成為高通量或半高通量的篩選技術(shù)。 在國(guó)內(nèi)首次構(gòu)建了RT活性的ELISA檢測(cè)法，應(yīng)用預(yù)先包被于Covalink96孔板的poly(A)模板和不同來源的RT將生物素標(biāo)記的dUTP摻入，用辣根過氧化物酶反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)酶活性，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，反映酶活性的OD值的大小與時(shí)間呈線性關(guān)系。通過與放射性核素?fù)饺霗z測(cè)法進(jìn)行比較，顯示兩種方法有明顯的一致性(HIV-1RT：r2=0.997)。

3、應(yīng)用ELISA法檢測(cè)奈韋拉平(NVP)、膦甲酸鈉(PFA)對(duì)HIV-1RT活性的抑制作用，顯示出藥物作用的劑量依賴性，測(cè)得IC50分別為0.23±0.12g/ml、0.21±0.08g/ml。同時(shí)，對(duì)ELISA法的重復(fù)性、穩(wěn)定性及用于抑制劑研究的特異性和敏感性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，證明了應(yīng)用ELISA法檢測(cè)HIV-1RT的活性具有簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，適用于抗HIV-1RT藥物的大樣品量篩選工作，并可發(fā)展成為高通量技術(shù)。在成功構(gòu)建

4、HIV-1RTELISA檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，利用該方法，進(jìn)一步檢測(cè)了莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV-RT)、禽類成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT)及鴨乙型肝炎復(fù)制復(fù)合體(DHBVRCs)的活性，同時(shí)還檢測(cè)了HIV-1感染細(xì)胞上清中RT的活性，證明ELISA法適用于具有逆轉(zhuǎn)錄特征的多種病毒酶的體外活性檢測(cè)。 隨著高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)在艾滋病患者中的廣泛應(yīng)用，抗HIV感染的聯(lián)合化療取得了極大成功，HIV的傳播

5、得到了一定程度的控制，最新的研究表明，僅僅聯(lián)合使用兩個(gè)RT抑制劑如齊多夫定(AZT)和奈韋拉平(NVP)亦可使患者血液中HIV滴度降至檢測(cè)不到的水平。然而，HBV感染的治療卻面臨著相當(dāng)?shù)睦Ь常?)與抗HIVRT的藥物相比，可供選擇抗HBVRT的治療藥物十分有限；2)伴隨某種藥物的長(zhǎng)期單一應(yīng)用，耐藥病毒株不斷出現(xiàn)。尋找新的不同機(jī)制的抗HBV藥物，增加聯(lián)合用藥的候選藥物種類，是目前亟待解決的問題。 因此，在成功構(gòu)建RT活性的ELIS

6、A檢測(cè)法的基礎(chǔ)上，對(duì)多種RT抑制劑進(jìn)行了研究，其中RT抑制劑膦甲酸鈉(PFA，phosphonoformicacid)及其治療HBV的可能性引起了我們的關(guān)注。PFA是膦乙酸(PAA，phosphonoaceticacid)的同類物，是一個(gè)人工合成的小分子化合物，分子量300.1，當(dāng)前在臨床上主要應(yīng)用于皮膚黏膜單純皰疹病毒(HSV)感染、帶狀皰疹病毒(VZV)感染及免疫缺陷者(如艾滋病患者)發(fā)生的巨細(xì)胞病毒(CMV)性視網(wǎng)膜炎。

7、PFA有三個(gè)特點(diǎn)不同于抗HBV的傳統(tǒng)RT抑制劑(如3TC)：1)PFA是一個(gè)小分子焦磷酸鹽類似物，結(jié)構(gòu)上與核苷類似物3TC不同，2)作用位點(diǎn)是病毒DNA多聚酶的磷酸鹽結(jié)合部位，不同于3TC竟?fàn)幉《綝NA多聚酶的底物結(jié)合位點(diǎn)，3)區(qū)別于3TC，PFA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)即可發(fā)揮抑酶活性，不依靠病毒的胸腺嘧啶激酶(TK)和/或宿主細(xì)胞的激酶激活形成3TC三磷酸化的活性形式。基于對(duì)PFA以上特征的高度關(guān)注，我們開展了PFA抗HBV感染的研究。

8、本研究的目的是研究PFA應(yīng)用于HBV感染治療的機(jī)制與療效。放射性核素?fù)饺敕w外酶抑制實(shí)驗(yàn)顯示，PFA對(duì)DHBVDNA多聚酶、HBVDNA聚合酶活性均有抑制作用，抑制曲線均顯示劑量依賴性，IC50分別為1.25±0.04μg/ml、18.70±1.11μg/ml。對(duì)于人工轉(zhuǎn)染HBV全基因組的HepG2細(xì)胞(2.2.15細(xì)胞)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物處理細(xì)胞9天后，PFA明顯抑制細(xì)胞中HBVDNA復(fù)制，與細(xì)胞對(duì)照組相比，細(xì)胞中HBVRC

9、-DNA、DS-DNA及HBVDNA總量顯著減少，且PFA的藥效顯示出明顯的劑量依賴性，并可對(duì)病毒酶產(chǎn)生直接抑制作用，無需磷酸化過程。 在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，一日齡雛鴨靜脈注射DHBV7天后，PFA腹腔注射給藥，日兩次，用藥14天后，與病毒對(duì)照組比較，血清中HBVDNA和鴨乙肝表面抗原(DHBsAg)明顯減少(250mg/kg組，P＜0.01；125mg/kg組，P＜0.05)，鴨肝臟中DHBVDNA復(fù)制受到顯著抑制，DS-DNA(

10、250mg/kg組，P＜0.001；125mg/kg組，P＜0.01)和cccDNA(250mg/kg組，P＜0.01；125mg/kg組，P＜0.05)的數(shù)量明顯減少。在鴨乙型肝炎模型中，PFA的藥效亦顯示出明顯的劑量依賴性。 在進(jìn)一步的研究中，我們將PFA用于治療臨床上不同類型的慢性乙型肝炎患者，患者體內(nèi)HBV負(fù)荷明顯下降，病情得到改善。第一組病人為31例未接受過任何抗病毒治療措施的慢性活動(dòng)性肝炎患者，接受PFA靜脈注射治療

11、，每天1g，日兩次，用藥4周，血液中HBV活動(dòng)性復(fù)制的重要臨床指標(biāo)HBVDNA下降99.7％(p＜0.05)，HBeAg下降96％(p＜0.01)，同用藥前相比，有顯著性差異。與PFA的抗病毒療效一致，反映肝功能指標(biāo)的ALT(p＜0.001)，AST(p＜0.001)，γ-GT(p＜0.01)，與用藥前相比，顯著降低，表明患者肝功能明顯改善。第二組為21例由于病毒產(chǎn)生YMDD突變而導(dǎo)致3TC抗藥性的慢性活動(dòng)性肝炎患者，接受PFA治療28

12、天后，患者血液中HBeAg和HBVDNA與PFA治療前相比，顯著下降(p值小于0.01)，HBV復(fù)制水平明顯降低；ALT、AST、γ-GT水平下降，肝功能明顯改善。這些結(jié)果與第一組病例相一致。第三組是13例伴有嚴(yán)重肝損傷的重癥肝炎的患者，接受PFA治療前一直服用傳統(tǒng)中藥而未接受過3TC治療。經(jīng)過四周PFA治療后，同用藥前相比，血液中HBeAg(p＜0.01)、HBVDNA(p＜0.05)、AST(p＜0.05)、ALT(p＜0.02)的

13、水平顯著下降，黃疸消失，表明患者體內(nèi)乙肝病毒的復(fù)制受到明顯抑制，肝功能改善，癥狀減輕。以上三組病例血液中的HBVDNA、HBeAg、ALT、AST均顯著下降，表明HBV的復(fù)制得到控制，肝功能改善；而通過對(duì)第一組慢性活動(dòng)性肝炎病例PFA治療前后腎功能指標(biāo)(尿素氮、血肌酐)的檢測(cè)，表明患者腎功能正?；驘o明顯變化。 鑒于已取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及傳統(tǒng)抗肝炎藥3TC在HBVDNA多聚酶上的作用位點(diǎn)區(qū)別于PFA，我們初步探索了PFA與3TC聯(lián)合

14、進(jìn)行抗HBV治療的可能性。對(duì)于2.2.15細(xì)胞，用PFA和3TC聯(lián)合處理細(xì)胞，藥物處理細(xì)胞9天后，結(jié)果顯示，與單獨(dú)給藥組相比，兩種藥物劑量比例適當(dāng)?shù)穆?lián)合給藥組細(xì)胞中HBVDNA總量減少更為顯著，明顯優(yōu)于PFA和3TC單獨(dú)給藥組，并呈現(xiàn)藥物協(xié)同作用。在DHBV感染雛鴨動(dòng)物模型中，單獨(dú)給藥組動(dòng)物PFA腹腔注射給藥，3TC灌胃給藥，聯(lián)合給藥組動(dòng)物同時(shí)給予PFA腹腔注射和3TC灌胃，通過檢測(cè)鴨肝DHBVDNA含量，發(fā)現(xiàn)兩種藥物劑量比例適當(dāng)?shù)穆?lián)合

15、給藥組療效更為顯著，與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)論相同，并呈現(xiàn)顯著的藥物協(xié)同作用。 綜上所述，PFA是一個(gè)小分子全合成的病毒DNA多聚酶抑制劑，阻斷HBVDNA多聚酶的磷酸鹽結(jié)合部位并抑制HBVDNA復(fù)制。本研究在體外酶水平、細(xì)胞水平、DHBV動(dòng)物模型體內(nèi)、慢性活動(dòng)性肝炎患者體內(nèi)四個(gè)層面綜合和深入分析了PFA在抗HBV感染方面的理論并嚴(yán)格證實(shí)了其臨床療效，并展示了其與3TC聯(lián)合用藥的協(xié)同作用。由此，我們認(rèn)為，PFA在HBV感染者的治療中，有實(shí)