桑樹內(nèi)生拮抗細(xì)菌Burkholderia cepacia Lu10-1的分離鑒定及其侵染定殖規(guī)律研究.pdf

1、桑樹(Morus alba L.)在我國的栽培已有七千多年的歷史,是蠶業(yè)生產(chǎn)的重要物質(zhì)基礎(chǔ),也是傳統(tǒng)的藥用植物。但近年來桑樹病害的發(fā)生表現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì),嚴(yán)重阻礙了蠶桑生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。現(xiàn)階段對(duì)各種桑樹病害的防治很大程度上依賴于化學(xué)農(nóng)藥的使用,由此帶來的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等諸多問題引起人們廣泛關(guān)注。因而,尋求對(duì)桑樹病害合理有效的防治措施已勢(shì)在必行。 作為一類新型的生防因子,植物內(nèi)生細(xì)菌是定殖在健康植物的各種組織和器官中,與植物

2、之間形成互惠共存、相互制約的和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物。其不易受環(huán)境條件的影響,可在植物體內(nèi)長期定殖和傳導(dǎo),更有利于發(fā)揮生防作用,已成為植物病害生物防治上一類極具應(yīng)用潛能的資源菌。因此,從桑樹體內(nèi)分離篩選有益細(xì)菌應(yīng)用于桑樹病害的生物防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義,但目前尚未見有桑樹內(nèi)生細(xì)菌的相關(guān)研究報(bào)道。 鑒于此,本研究對(duì)從健康桑樹葉片中分離到的一株內(nèi)生拮抗細(xì)菌Lu10-1進(jìn)行了系統(tǒng)的分類學(xué)鑒定,并測(cè)定了該內(nèi)生細(xì)菌在桑樹體內(nèi)的定殖數(shù)量消長

3、動(dòng)態(tài),探討了該菌株在桑樹體內(nèi)的侵染定殖規(guī)律。主要研究結(jié)果如下： 1.對(duì)桑樹內(nèi)生拮抗細(xì)菌Lu10-1進(jìn)行了抑菌譜的測(cè)定。結(jié)果表明,菌株Lu10-1對(duì)9株供試植物病原真菌、2株革蘭氏陰性及1株革蘭氏陽性病原細(xì)菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性,抑菌譜較廣；病原菌中包括桑炭疽病菌(Colletotrichum morifolium)、桑粘格孢菌(Septogloeum mori)、桑丁香假單孢桿菌(Pseudomonas syringae pv

4、.mori)三株桑樹主要病原菌。 2.對(duì)菌株Lu10-1進(jìn)行了系統(tǒng)的分類學(xué)鑒定。結(jié)果表明,Lu10-1菌株歸屬于洋蔥伯克霍爾德氏菌基因型Ⅰ(Burkholderia cepacia genomovar Ⅰ),菌株的16S rDNA序列已在GenBank中注冊(cè),登錄號(hào)為EF546394。 3.采用雙抗藥性標(biāo)記法測(cè)定了Burkholderia cepacia Lu10-1在桑樹體內(nèi)的數(shù)量消長動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明,Lu10-1菌株可

5、通過浸種、浸根、涂葉和針刺等接種方法進(jìn)入桑樹體內(nèi)定殖,并證實(shí)了該內(nèi)生細(xì)菌能夠在桑樹體內(nèi)不同組織之間轉(zhuǎn)移和傳導(dǎo)。Lu10-1菌株浸種接種后,細(xì)菌在桑樹體內(nèi)的定殖數(shù)量總體上呈現(xiàn)下降趨勢(shì),到第20天后菌量趨于穩(wěn)定；細(xì)菌浸根接種后,在根、莖和葉中定殖的菌量均呈現(xiàn)出“先增后降”的趨勢(shì)。該菌株可在桑樹體內(nèi)長期定殖,且在定殖過程中菌株的拮抗性能未改變。 4.用掃描電子顯微鏡觀察了Burkholderia cepacia Lu10-1對(duì)桑樹根的

6、吸附和侵染情況。結(jié)果表明,Lu10-1菌株在桑樹根各區(qū)的吸附和分布存在較大差異,根成熟區(qū)根毛表面和伸長區(qū)為內(nèi)生細(xì)菌Lu10-1在根表面吸附的優(yōu)先位點(diǎn)。該菌可從主根與側(cè)根的交聯(lián)處、根毛分生處、根毛表面、外表皮裂痕以及根外表皮細(xì)胞的間隙等部位直接侵入到桑樹根表皮內(nèi)。 5.用gfp基因標(biāo)記了Burkholderia cepacia Lu10-1。結(jié)果表明,標(biāo)記細(xì)菌在481 nm的藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出明亮的綠色熒光,gfp基因在Lu10-1菌

7、株中得到了很好的表達(dá)。且pGFP4412質(zhì)粒在菌株Lu10-1中的遺傳穩(wěn)定性較強(qiáng),可以滿足在桑樹體內(nèi)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的需要。 6.用激光共聚焦掃描顯微鏡實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)了Burkholderia cepacia Lu10-1在桑樹體內(nèi)的侵染、轉(zhuǎn)移、傳導(dǎo)和定殖全過程。結(jié)果表明,該菌主要從主根與側(cè)根交聯(lián)處,根毛分生處和根毛進(jìn)入桑樹根的皮層和中柱,通過輸導(dǎo)組織向桑樹莖部、葉柄和葉片中遷移,主要定殖在桑樹各維管組織和皮層的細(xì)胞間隙,細(xì)胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)標(biāo)記細(xì)菌