綠茶多糖的酶法修飾改性及構(gòu)效變化的研究.pdf

1、茶葉多糖具有很好的降血糖和抗氧化活性，是茶葉中繼多酚以后的另一種重要的功能性成分。酶法修飾多糖是近年來研究的熱點之一。利用酶法修飾多糖能改變多糖生物活性。本文利用糖苷酶水解綠茶中提取的茶多糖，系統(tǒng)研究酶法修飾前后茶多糖分離純化技術(shù)，理化性質(zhì)和一級結(jié)構(gòu)，同時比較二者的抗氧化與免疫調(diào)節(jié)活性，并對二者的溶液行為和微觀形貌進(jìn)行系統(tǒng)的比較。結(jié)合酶工程嘗試尋找改善茶多糖活性的方法，篩選茶多糖高活性的優(yōu)勢構(gòu)象。主要研究結(jié)果如下：
　　 1茶葉

2、中半乳糖苷酶的初步研究
　　 采用單因素和正交試驗方法對茶葉中β-D-半乳糖苷酶的比活力測定條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，茶葉中β-D-半乳糖苷酶比活力測定條件為：以pH4.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液作為緩沖體系抽提4h，離心處理兩次得到酶溶液，以0.2ml10mmol/L的pNPG溶液為底物，置于溫度60℃水浴中7min，反應(yīng)后加入lmol/LNaCO3終止反應(yīng)。對不同茶葉品種、生長季節(jié)以及不同嫩度葉片中的β-D-半乳糖苷酶比活力

3、進(jìn)行分析。結(jié)果表明，烏龍茶與綠茶品種中β-D-半乳糖苷酶比活力差異明顯，不同季節(jié)與不同嫩度茶葉葉片之間也存在較大變化。4月和7月，兩種糖苷酶的活性都比較高，芽具有較高的糖苷酶活性。比較毛蟹和鐵觀音兩個品種烏龍茶加工過程β-D-半乳糖苷酶與β-D-葡萄糖苷酶的變化，表明毛蟹和鐵觀音β-D半乳糖苷酶活性都呈顯著的下降趨勢，但鐵觀音中β-D-葡萄糖苷酶活性則呈先降后升再降的趨勢。
　　 2綠茶多糖的酶法改性及其對體外抗氧化活性和免疫活

4、性的影響
　　 利用茶葉中提取的糖苷酶對綠茶多糖進(jìn)行酶法修飾改性，以茶多糖清除羥基自由基和超氧陰離子自由基的能力大小為評判指標(biāo)，結(jié)合單因素與正交實驗。結(jié)果表明，綠茶多糖酶法修飾改性的優(yōu)化條件為：酶水解溫度35℃，多糖濃度5mg/ml，水解時間30min和酶濃度為設(shè)定值1。通過酶法修飾改性后的茶多糖，體外清除自由基能力有了顯著提高，ETPS與TPS相比較，在清除羥基自由基能力方面較后者提高49％，清除超氧陰離子能力方面提高33%。

5、它們的糖含量與蛋白質(zhì)差異不大。
　　 首次就茶多糖對環(huán)磷酰胺抑制的免疫低下模型小鼠的免疫功能進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，TPS與ETPS在免疫低下模型小鼠的細(xì)胞免疫功能，體液免疫功能，單核一巨噬細(xì)胞功能和NK細(xì)胞活性4個方面的實驗中，結(jié)果均呈陽性，說明它們均具有明顯的增強(qiáng)免疫功能的作用，其作用途徑一方面促進(jìn)免疫器官的修復(fù)，另一方面通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞的活性和通過體液免疫途徑來實現(xiàn)。試驗結(jié)果還表明，酶法修飾改性能顯著提

6、高綠茶多糖的免疫活性。在同等劑量下，改性后的茶多糖ETPS與原多糖TPS相比能提高脾指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)，能顯著提高DTH試驗耳腫程度、血清HC50、NK細(xì)胞活性。但在提高胸腺指數(shù)、ConA誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞的增殖、溶血空斑數(shù)以及小鼠碳廓清吞噬指數(shù)方面要比原多糖差一些。提示一方面綠茶多糖經(jīng)過酶法修飾改性后免疫活性明顯增強(qiáng)，有利于提高免疫活性，另一方面也說明多糖經(jīng)過酶法修飾改性后免疫途徑發(fā)生了一定變化。
　　 3茶多糖一

7、級結(jié)構(gòu)表征
　　 將酶水解前后的茶多糖經(jīng)DEAE-52纖維素與Sephadex G-150柱層析分離純化得到兩個相對均一組分TPS2-1和ETPS2-1，通過紫外光譜、紅外光譜、核磁共振、氣相色譜、高碘酸氧化等方法對它們的的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析比較。結(jié)果表明，ETPS2-1中性糖含量低于TPS2-1，糖醛酸含量高于TPS2-1，都具有糖綴合物的特性。TPS2-1的相對分子質(zhì)量為36.98×104，分散系數(shù)(MW/Mn)為2.0

8、4，單糖組成及摩爾比：Rha: Rib: Ara: Xyl: Man: Cal: Glu=1.27:0.20:7.19:0.28:0.30：1.25:8.21。ETPS2-1的相對分子質(zhì)量為18.71×104，分散系數(shù)(MW/Mn)為1.81，單糖組成及摩爾比：Rha: Rib: Ara: Xyl: Man: Cal: Glu=1.34:0.05:6.24:0.48:0.13:0.77:7.05。紅外光譜分析二者均含有呋喃環(huán)和吡喃環(huán)。核

9、磁分析表明分子主鏈主要以β-D葡萄糖苷鍵(1→4)連接以及(1→6)連接方式鏈結(jié)，阿拉伯糖和半乳糖主要以呋哺型糖苷的形式鏈接于支鏈上。
　　 4茶多糖溶液行為與形貌特征研究
　　 利用粘度測定、GPC-LLS、CD、AFM、SEM、以及熱特性分析技術(shù)研究綠茶多糖酶法改性前后高級結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，TPS2-1與ETPS2-1在溶液中的分布都是不均一的，粘度均很低，TPS2-1的特征粘度和分子粒徑大于ETPS2-1。CD

10、分析結(jié)果表明，多糖主要顯示負(fù)的Cotton效應(yīng)，ETPS與TPS分子具有不同的對稱性。原子力顯微鏡(AFM)觀察結(jié)果表明，TPS2-1多糖分子呈鏈狀結(jié)構(gòu)和分枝葉片狀，而ETPS2-1糖分子呈現(xiàn)一些比較規(guī)則的圓盤狀，圓盤上均勻聚集顆粒狀物質(zhì)。經(jīng)過改良后的掃描電鏡(SEM)觀察結(jié)果表明，TPS2-1表面光滑，呈現(xiàn)一種片層狀形態(tài)。ETPS2-1由小顆粒聚集形成規(guī)則的片狀形態(tài)，但沒有堆積聚集現(xiàn)象，顆粒狀分子排列緊密，呈平鋪狀態(tài)。綜合熱分析儀分析

11、表明，TPS2-1和ETPS2-1多糖的聚集態(tài)中都存在多種結(jié)構(gòu)的聚集狀態(tài)，所表現(xiàn)出的熱特性規(guī)律存在一定差異。由此說明綠茶多糖經(jīng)過酶法修飾改性后，溶液行為和立體形貌特征已經(jīng)發(fā)生明顯變化。
　　 利用CD、AFM、SEM方法深入分析酸堿情況下烏龍茶多糖的溶液行為和微觀形貌。結(jié)果表明，酸堿環(huán)境都引起TPS2-1與ETPS2-1多糖分子的不對稱性，構(gòu)象發(fā)生顯著變化，基本上都呈現(xiàn)酸性環(huán)境促進(jìn)多糖分子的分散，堿性環(huán)境則促進(jìn)分子的聚集的趨勢。

12、這種溶液行為和微觀形貌的變化對活性有顯著影響。
　　 首次利用CD、AFM、SEM方法分析不同金屬離子與酶法改性前后茶葉多糖的絡(luò)合效應(yīng)與抗氧化活性。結(jié)果表明，Pb2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Na+、K+、Mg2+離子中，Pb2+嚴(yán)重抑制了茶葉多糖的抗氧化活性，而Mn2+、Zn2+離子則顯著增強(qiáng)了茶葉多糖的抗氧化活性。CD、AFM、SEM分析結(jié)果表明，鉛離子顯著改變了TPS2-1和ETPS2-1鏈的結(jié)構(gòu)與鏈構(gòu)象，打破了多糖