煙草青枯菌拮抗細(xì)菌swu31-2的分離及其生物防治效果的研究.pdf

1、青枯病(tobacco bacterial wilt)是一種由布可氏桿菌(Ralstonia$olanacearum)引起的細(xì)菌性土傳病害，是熱帶，亞熱帶和一些溫暖地區(qū)煙草的重要病害。該病在我國(guó)長(zhǎng)江流域及以南煙區(qū)普遍發(fā)生，為害嚴(yán)重，個(gè)別年份常常暴發(fā)流行，造成毀滅性損失。目前，煙草青枯病的防治十分困難，生產(chǎn)上主要采用農(nóng)業(yè)措施和化學(xué)防治為主，農(nóng)業(yè)措施防治法受環(huán)境和栽培條件的限制，實(shí)施起來較困難；而化學(xué)防治具有環(huán)境污染嚴(yán)重、殘留藥物對(duì)人畜危害

2、大、容易誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生耐藥性等問題，逐漸引起嚴(yán)重的社會(huì)問題，受到了嚴(yán)重的質(zhì)疑和挑戰(zhàn)。與之相比，生物農(nóng)藥具有無污染、無公害、對(duì)人畜毒性低及環(huán)境壓力小等優(yōu)點(diǎn)。因此，生物農(nóng)藥的研制與開發(fā)具有很大的價(jià)值和潛力。 本研究以生物防治煙草青枯病為目的，以具有強(qiáng)致病力的青枯菌為指示菌，從煙草根際土壤中分離得到一株對(duì)煙草青枯病有較強(qiáng)拮抗活性的銅綠假單胞菌(Pseudomonas sp.)，編號(hào)為SWU31-2。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了菌株的鑒定、發(fā)酵條

3、件的優(yōu)化、活性物質(zhì)的初步分離純化和部分理化性質(zhì)研究、菌株在煙草上的定殖能力及對(duì)煙草青枯病的盆栽試驗(yàn)等研究工作。主要結(jié)果如下： 1.重慶黔江石郎煙區(qū)煙草青枯菌生化型和致病力調(diào)查 采集具典型青枯病癥狀的煙株，進(jìn)行病原菌分離及致病力檢測(cè)。共分離到36株青枯菌株。根據(jù)Hayward劃分青枯病菌的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其中的24株病原菌進(jìn)行生化型的歸類。結(jié)果表明，其中有5株病原菌屬于Ⅲ-1，約占20.83％；另19株煙草青枯菌株屬于生化型Ⅲ，約

4、占79.17％。致病力檢測(cè)結(jié)果表明，在36株病原菌中有8株致病力強(qiáng)、13株致病力中等、15株致病力較弱。強(qiáng)致病力病原菌的獲得，為后續(xù)的拮抗菌篩選和防治研究提供了有利的靶標(biāo)。 2.拮抗菌株的分離、篩選及鑒定 以篩選到的8株強(qiáng)致病力青枯菌株為靶標(biāo)，從煙草根際土壤中篩選出具抑制病原菌的拮抗菌swu31-2菌株，對(duì)此菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)的分類鑒定．研究結(jié)果表明，在抑制青枯菌平板實(shí)驗(yàn)中，swu31-2菌株的活性物

5、質(zhì)存在于胞內(nèi)；連續(xù)傳代10次后，swu31-2菌株產(chǎn)生的活性物質(zhì)對(duì)病原菌仍然具有較穩(wěn)定地抑制作用。形態(tài)特征、生理生化特性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，swu31-2菌株為革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，無芽孢，具鞭毛，能運(yùn)動(dòng)的好氧菌；在馬鈴薯固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后，菌體生長(zhǎng)良好，有明顯的綠色色素產(chǎn)生；明膠液化、接觸酶反應(yīng)、氧化酶反應(yīng)及膿青素反應(yīng)均呈陽性，4℃不生長(zhǎng)，41℃能生長(zhǎng)；16S rDNA序列分析顯示其序列與銅綠假單胞菌(Pseudomonasaerugino

6、sa)AAQW01000001序列、AAqQE01000095序列及AAQE01000031序列的16S rDNA同源性均高達(dá)99％。綜合各項(xiàng)指標(biāo)鑒定的結(jié)果，鑒定該菌株屬于假單胞菌屬的銅綠假單胞菌，命名為Pseudomonasaeruginosa swu31-2。 3.swu31-2菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化 對(duì)swu31-2菌株發(fā)酵條件作了優(yōu)化研究，得到培養(yǎng)基的最佳碳源為甘油，氮源為豆餅粉，金屬離子為Mg2+，磷酸鹽為K2HP

7、o|以及最適溫度為30℃，接種量為3％，初始pH值為8.0，裝瓶量為30％，發(fā)酵時(shí)間為36h。通過正交試驗(yàn)得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基各組分：甘油3％，豆餅粉5％，MgSO4 7H200.3％，K2HPO40.05％，與King's B發(fā)酵培養(yǎng)基相比．利用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生的細(xì)菌數(shù)從1.49× 1010個(gè)/mL提高到6.23× 1010個(gè)/mL，抑菌圈直徑從20.7mm提高到28.2mm． 4.swu31.2菌株活性物質(zhì)初步地分離純化

8、及其理化性質(zhì)研究 利用有機(jī)溶劑沉淀、離心法去除雜蛋白及硅膠柱初步分離純化swu31-2菌株的活性物質(zhì)，并初步探索了拮抗菌株swu31-2活性物質(zhì)的理化特性。結(jié)果表明，活性物質(zhì)能夠較好地耐酸堿、耐高溫，對(duì)蛋白酶K不敏感；且活性物質(zhì)能不同程度的溶解于甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和水中，其中在甲醇中溶解性最好；利用氯仿和乙酸乙酯分別萃取水相中的活性物質(zhì)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)仍存在于水相中．綜合各項(xiàng)結(jié)果，初步判斷swu31-2菌株的活性物質(zhì)可

9、能為非蛋白類的小分子物質(zhì)，為后續(xù)的分離和純化提供一定的理論基礎(chǔ)。 5.swu31-2菌株在煙草上的定殖能力及對(duì)煙草青枯病的防治作用 首先為獲得標(biāo)記菌株，通過逐步提高鏈霉素(Streptomycin,Sue)濃度的方法，獲得了抗300pμg/mL Stre的自發(fā)突變菌株，記為swe31-2*。同時(shí)研究結(jié)果表明，標(biāo)記菌株具有穩(wěn)定的抗藥性，且與原始菌株具有同等的平板抑制作用和盆栽防治效果，可以作為swu31-2菌的標(biāo)記菌株進(jìn)行

10、定殖研究。 Sswu31-2*菌的定殖試驗(yàn)結(jié)果表明，swu31-2*菌株可以很快地定殖到煙草各組織表面及內(nèi)部，在菌懸液灌根處理1d后，就能在煙草根、莖、葉內(nèi)部檢測(cè)到swu31-2*菌。在8d左右定殖量最大，根、莖、葉分別達(dá)到5.57×107、6.79×106、3.65×106cfu/g，之后有所下降，而對(duì)照中無任何菌落長(zhǎng)出．這說明swu31-2菌具有內(nèi)生性特征．同時(shí)，定殖20d的檢測(cè)結(jié)果表明，swu31-2*雖有下降趨勢(shì)，但仍含

11、有較高的細(xì)菌數(shù)量，在含量最低的葉內(nèi)也有1.30×105 cfu/g*殖數(shù)量消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)表明，swu31-2*菌在煙草根、莖、葉內(nèi)部均有一個(gè)“由升到降”的數(shù)量變化趨勢(shì)；swu31-2*菌在煙草各組織內(nèi)部定殖能力強(qiáng)弱為：根＞莖＞葉。另外，灌根后20d，仍能在煙草根、莖、葉表面檢測(cè)到標(biāo)記菌株，說明swu31-2菌能夠長(zhǎng)時(shí)間定殖于煙草各組織表面。 分別利用菌株swu31-2的菌液和活性物質(zhì)進(jìn)行煙草青枯病的盆栽防治試驗(yàn).研究結(jié)果表明，swu3