阿魏酸鈉苦參素聯(lián)合用藥對膿毒血癥的治療作用及機(jī)制的研究.pdf

1、膿毒血癥是由嚴(yán)重感染而引發(fā)的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，容易導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(MODS)，是臨床上和重癥監(jiān)護(hù)室中病人死亡的常見原因之一。膿毒血癥的主要發(fā)病機(jī)制在于失控的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)擾亂了機(jī)體的正常循環(huán)和基礎(chǔ)代謝狀態(tài)，同時，研究也表明細(xì)菌內(nèi)毒素也是誘發(fā)膿毒癥的重要原因之一，膿毒血癥一旦引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)，能迅速造成器官損傷，有較高的自然死亡率。
　　本課題采用盲腸結(jié)扎穿孔的方法探索阿魏酸鈉（sodium ferulate，SF）和苦參素

2、（oxymatrine，OMT）聯(lián)合用藥對盲腸結(jié)扎穿孔所致的膿毒血癥的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。
　　取swiss小鼠，雌雄各半，體重18～22g，隨機(jī)分為2組：每組10只，空白組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）。模型組采用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）造模，空白組模擬開腹手術(shù)。密切觀察各組小鼠的死亡情況，記錄小鼠的死亡時間，統(tǒng)計8h、16h、24h小鼠死亡率。采用CLP建造膿毒血癥模型后，空白組沒有小鼠死亡，模型組小鼠出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。8

3、h內(nèi)模型組小鼠死亡率為0％，而16h內(nèi)模型組小鼠死亡率為80%，24h時模型組小鼠全部死亡。
　　取swiss小鼠，雌雄各半，體重18～22g，隨機(jī)分為4組：每組10只，空白組（8h空白組、16h空白組）、模型組（8h模型組、16h模型組）。實驗前禁食不禁水12h。模型組小鼠均采用CLP造模，空白組小鼠模擬開腹手術(shù)。測定小鼠肺組織濕干比；用全自動分析儀測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase

4、，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-oxalacetic transaminease，AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平代表肝損傷的程度。采用CLP手術(shù)后8h和16h小鼠肺組織濕干比重明顯增加（8h和16h模型組分別為5.1±0.52和5.3±0.42，空白組分別為3.9±0.21和3.8±0.48），ALT、AST和LDH水平明顯升高ALT：8h和16h模型組分別為96±7.81和99

5、±9.20 U/L，空白組分別為43±4.65 U/L和43±3.52 U/L；AST：8h和16h模型組分別為66±5.47和78±6.64 U/L，空白組分別為97±17.29 U/L和96±13.28 U/L；LDH：8h和16h模型組分別為538±50.7和564±60.3 mmol/L，空白組為342±38.2 mmol/L和328±26.4 mmol/L，8h組和16h組比較，肺組織濕干比、ALT、AST和LDH水平未見明顯

6、統(tǒng)計學(xué)差異。
　　取swiss小鼠，雌雄各半，體重18～22g，隨機(jī)分為9組：空白組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、7個復(fù)方組SF+OMT(1.6+3.4，3.1+6.9，6.2+13.8,12.3+27.7，24.8+55.2，49.6+110.4，99.2+220.8 mg/kg)，復(fù)方組按SF+OMT摩爾比1:2配比，每組5只。實驗前禁食不禁水12h。模型組及藥物組小鼠均采用CLP造模，空白組小鼠模擬開腹手術(shù)。藥物組分別于

7、造模后立即腹腔注射相應(yīng)劑量藥物，空白組和模型組給予等體積生理鹽水。測定小鼠肺組織濕干比；用全自動分析儀測定血清中ALT、AST和LDH水平代表肝損傷的程度。實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，其中SF+OMT劑量為6.2+13.8 mg/kg以上時，小鼠肺組織濕干比顯著降低，血清ALT、AST和LDH水平明顯降低（P<0.05），其中SF+OMT（12.3+27.7 mg/kg）保護(hù)效果達(dá)到高峰，繼續(xù)增加劑量未見療效明顯增加，3.1+6.9 m

8、g/kg及其以下劑量組未見明顯的保護(hù)作用。
　　取swiss小鼠，雌雄各半，體重18～22g，隨機(jī)分為7組，每組30只：空白組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、SF組(6.2 mg/kg)、OMT組(13.8 mg/kg)、三個復(fù)方組SF+OMT(3.1+6.9，6.2+13.8，12.3+27.7 mg/kg)，復(fù)方組按SF+OMT摩爾比1:2配比。實驗前禁食不禁水12h。模型組及藥物組小鼠均采用CLP造模，空白組小鼠模擬開腹手

9、術(shù)。藥物組分別于造模后立即腹腔給藥相應(yīng)劑量藥物，空白組和模型組給予等體積的生理鹽水。用全自動分析儀測定血清中ALT、AST和LDH水平代表肝損傷的程度；酶法測定肺組織和肝組織中丙二醛（Malondialdehyde，MDA)水平、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性代表肝組織氧化損傷的指標(biāo)；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清、肺組織和肝組織中C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP

10、）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)的水平代表肝組織炎癥反應(yīng)水平和藥物的抗炎作用，并與SF（6.2 mg/kg）、OMT（13.8 mg/kg）單獨(dú)用藥的作用進(jìn)行比較。與模型組比較，復(fù)方高、中劑量組小鼠肺濕干比明顯降低（高、中劑量組分別為4.22±0.24和4.48±0.25模型組為4.88±0.35，P<0.05）；血清ALT、AST、LDH水平明顯降低（ALT：高、

11、中劑量組分別為67.51±6.84和82.44±6.03 U/L，模型組為96.88±5.68 U/L，P<0.05；AST：高、中劑量組分別為48.43±5.41和53.99±5.39 U/L，模型組為65.50±5.78 U/L，P<0.05；LDH:高、中劑量組分別為414.83±29.62和427.29±32.41 mmol/L，模型組為526.89±34.20 mmol/L，P<0.01）；肺組織和肝組織SOD活性明顯增高（肺

12、組織高、中劑量組分別為10.43±1.82和9.32±0.96 U/mg protein，模型組為7.93±1.68 U/ml，P<0.01；肝組織高、中劑量組分別為15.38±1.12和14.08±0.71 U/mg protein，模型組為13.68±1.33 U/mg protein，P<0.05）；肺組織和肝組織MDA水平明顯降低（肺組織高、中劑量組分別為1.26±0.78和1.47±0.71 nmol/mg protein，模

13、型組為17.4±0.85 nmol/mg protein，P<0.05；肝組織高、中劑量組分別為1.07±0.13和1.15±0.07 nmol/mg protein，模型組為1.33±0.09 nmol/mg protein，P<0.05），血清、肺組織和肝組織CRP水平明顯降低（血清高、中劑量組分別為385.72±23.55和425.11±24.25 ng/ml，模型組為467.61±31.24 ng/ml，P<0.05；肺組織高、

14、中劑量組分別為60.71±4.57和65.51±6.86 ng/mg protein，模型組為72.32±7.45 ng/mg protein，P<0.05；肝組織高、中劑量組分別為42.12±2.62和46.47±2.48 ng/mg protein，模型組為54.31±2.18 ng/mg protein，P<0.05），血清、肺組織和肝組織IL-6水平明顯降低（血清高、中劑量組分別為109.39±20.59和154.45±25.8

15、4 pg/ml，模型組為273.97±17.57 pg/ml，P<0.01；肺組織高、中劑量組分別為11.35±1.41和11.87±1.57 pg/mg protein，模型組為15.11±1.16 pg/mg protein，P<0.01；肝組織高、中劑量組分別為12.43±0.86和14.70±0.92 pg/mg protein，模型組為18.60±1.14 pg/mg protein，P<0.01），血清、肺組織和肝組織IFN

16、-γ水平明顯降低（血清高、中劑量組分別為108.17±9.25和117.83±7.51 pg/ml模型組為129.09±12.58 pg/ml，P<0.05；肺組織高、中劑量組分別為16.50±1.58和18.30±1.15 pg/mg protein，模型組為21.02±2.97 pg/mg protein，P<0.05；肝組織高、中劑量組分別為18.28±1.75和20.79±0.99 pg/mg protein，模型組為26.26

17、±1.03 pg/mg protein，P<0.01）。而SF、OMT單獨(dú)用藥組與模型組比較，各項指標(biāo)均未見顯著性變化。
　　體外抗氧化作用研究：采用LPS所致HepG2細(xì)胞損傷模型，評價SF和OMT聯(lián)合用藥（劑量分別是25+50，50+100，100+200，200+400，400+800μmol/L）在LPS損傷模型中的抗炎活性作用和保護(hù)效應(yīng)。采用ELISA的方法測細(xì)胞上清液中IL-6的水平，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞上清液中活性氧（

18、reactive oxygen species，ROS）水平，計算兩指標(biāo)的IC50值，酶法檢測細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、CAT水平，并計算ED50值。體外觀察SF和OMT聯(lián)合用藥對過氧化氫自由基（Hydrogen peroxide，H2O2）和超氧陰離子自由基（Superoxide anion，O2-.）的清除能力，并計算其IC50值。研究發(fā)現(xiàn)SF和OMT聯(lián)合用藥對HepG2細(xì)胞培育的上清液IL-6的抑制作用的抑制率最大可達(dá)69.78%，I

19、C50值為186.77+314.28μmol/L，呈良好的劑量依賴關(guān)系。抑制率明顯高于單獨(dú)用藥組（IC50值SF：346.68μmol/L，OMT：447.23μmol/L）。SF和OMT聯(lián)合用藥可以明顯降低細(xì)胞上清液中ROS水平，抑制作用明顯高于單方給藥組（IC50值SF+OMT：56.24+112.49μmol/L，SF：355.58μmol/L，OMT：426.21μmol/L）。同時，等效應(yīng)曲線分析說明，聯(lián)合用藥對降低細(xì)胞上清液

20、中的ROS水平具有明顯的協(xié)同作用。SF和OMT聯(lián)合給藥對MDA的抑制率最大可達(dá)43.06%，聯(lián)合用藥組對細(xì)胞內(nèi)MDA水平（ED50值SF+OMT：20.94+41.89μmol/L）的ED50值明顯小于單方用藥組（ED50值SF：89.09μmol/L，OMT：72.38μmol/L）；SF和OMT聯(lián)合用藥明顯提高細(xì)胞內(nèi)SOD活性，其作用明顯優(yōu)于單獨(dú)給予SF或OMT，聯(lián)合用藥組（ED50值SF+OMT：25.55+51.09μmol/L

21、）的ED50值明顯低于單方用藥組（ED50值SF：480.86μmol/L，OMT：170.07μmol/L）；SF和OMT聯(lián)合用藥明顯提高細(xì)胞內(nèi)CAT活性，其作用明顯優(yōu)于單獨(dú)給予SF或OMT，聯(lián)合用藥組ED50值為5.74+12.84 mmol/L，明顯低于SF和OMT單獨(dú)用藥組的ED50值（SF：30.31mmol/L；OMT：21.33 mmol/L）顯示聯(lián)合用藥作用明顯優(yōu)于單獨(dú)給藥。SF和OMT聯(lián)合用藥具有較強(qiáng)的清除H2O2和O

22、2-.自由基的能力。聯(lián)合用藥組對O2-.自由基清除能力明顯強(qiáng)于單獨(dú)給藥組，OMT單獨(dú)用藥組對O2-.自由基清除能力明顯強(qiáng)于SF單獨(dú)用藥組。聯(lián)合用藥組IC50值為3.41+6.82 mmol/L，明顯低于SF和OMT單獨(dú)用藥組的IC50值（SF：48.53mmol/L；OMT：14.91 mmol/L），協(xié)同作用分析顯示，聯(lián)合用藥對O2-.自由基清除作用起協(xié)同作用；聯(lián)合用藥組對H2O2自由基清除能力明顯強(qiáng)于單獨(dú)給藥組，OMT單獨(dú)用藥組對H