miR-210抑制食管Eca109細(xì)胞生長的機(jī)制研究.pdf

1、我國食管癌發(fā)病和死亡人數(shù)約占全球的二分之一。放射治療是目前食管癌主要的治療手段之一，但是5年生存率僅有10％～30％。研究表明，腫瘤乏氧細(xì)胞的產(chǎn)生和存在使腫瘤對(duì)放療的抗拒性增加，是影響腫瘤放射治療療效的主要原因之一。
　　乏氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的乏氧適應(yīng)性變化的關(guān)鍵調(diào)控因子。近年來的研究表明，miR-210作為HIF-1α新發(fā)現(xiàn)的下游靶基因，參與了多種

2、細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控，如:能量代謝、細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)等。已有研究證實(shí)，miR-210過表達(dá)可引起腫瘤細(xì)胞G1/S期和/或G2/M期阻滯，干擾有絲分裂進(jìn)程，抑制腫瘤生長。其中G1/S期阻滯與miR-210特異性抑制E2F轉(zhuǎn)錄因子3(E2Ftranscription factor3，E2F3)和成纖維細(xì)胞生長因子受體樣因子1（Fibroblast Growth Factor Receptor-like1，F(xiàn)GFRL1）的表達(dá)有關(guān)。然

3、而目前關(guān)于miR-210誘導(dǎo)G2/M期阻滯所涉及的靶基因還鮮有報(bào)道，具體調(diào)控機(jī)制也尚不明了。有研究稱原癌基因(c-MYC)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑Max結(jié)合蛋白(Max's next tango，MNT)也是miR-210的靶基因，在乏氧條件下，miR-210可以通過抑制它的表達(dá)加速細(xì)胞周期進(jìn)程。因此，miR-210調(diào)控細(xì)胞周期的機(jī)制及其對(duì)細(xì)胞增殖的具體影響都還有待進(jìn)一步揭示。
　　循環(huán)miRNA具有單鏈小分子特性，多以RNA/蛋白復(fù)合體的

4、形式存在，穩(wěn)定性比其他核酸分子高，RNA酶不易降解，適合作為分子標(biāo)志物。此前有3項(xiàng)研究分別報(bào)道了循環(huán)miR-210在胰腺、乳腺、腎臟腫瘤中高表達(dá)。盡管上述研究的樣本量較小，但結(jié)果的一致性表明循環(huán)miR-210的差異性表達(dá)或可為腫瘤診斷提供幫助。目前還未見食管癌患者循環(huán)miR-210表達(dá)情況的報(bào)道，而且此前的研究多關(guān)注于手術(shù)對(duì)腫瘤患者循環(huán)miRNA表達(dá)的影響，對(duì)于根治性放療前后循環(huán)miRNA表達(dá)的變化還鮮有報(bào)道。
　　本研究首先觀察

5、并檢測(cè)了人食管鱗癌Eca109細(xì)胞在乏氧條件下miR-210的表達(dá)情況，通過轉(zhuǎn)染miR-210 mimics觀察miR-210過表達(dá)對(duì)Eca109細(xì)胞增殪、周期、凋亡的影響，并探討其可能的作用機(jī)制;其次，應(yīng)用生物信息技術(shù)篩選出miR-210調(diào)控G2/M期轉(zhuǎn)換的可能靶基因Plk1，通過構(gòu)建熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pmiR-RB-REPORTTM-Plk1，檢驗(yàn)Plk1基因mRNA的3'UTR區(qū)域是否包含miR-210的作用結(jié)合位點(diǎn)，并檢測(cè)過表達(dá)m

6、iR-210對(duì)Plk1蛋白表達(dá)水平的影響，驗(yàn)證Plk1是否是miR-210的直接靶基因;最后，通過檢測(cè)食管癌患者及健康志愿者血漿miR-210的表達(dá)水平，并對(duì)比食管癌患者根治性放療前后血漿miR-210的表達(dá)變化，了解血漿miR-210對(duì)食管癌的診斷及放療療效評(píng)估價(jià)值。
　　第一部分 miR-210在乏氧食管Eca109細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的:檢測(cè)miR-210在乏氧食管Eca109細(xì)胞中的表達(dá)水平

7、，并探討其對(duì)細(xì)胞增殖、周期、凋亡的影響。
　　方法:RT-PCR檢測(cè)不同乏氧時(shí)相食管鱗癌Eca109細(xì)胞中miR-210的表達(dá)。采用CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、EdU增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-210過表達(dá)對(duì)Eca109細(xì)胞增殖、周期、凋亡的影響
　　結(jié)果:經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，Eca109細(xì)胞乏氧培養(yǎng)12h后miR-210的表達(dá)就有明顯增高，24h后達(dá)峰值，較常氧組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。CCK-8及EdU細(xì)胞增殖實(shí)

8、驗(yàn)顯示，miR-210 mimics轉(zhuǎn)染24、48h后Eca109/miR-210組增殖細(xì)胞活力比例均較Eca109/Control組和Eca109/ncRNA組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。流式細(xì)胞分析顯示，轉(zhuǎn)染24h后，同Eca109/Control和Eca109/ncRNA相比，Eca109/miR-210組出G2/M期細(xì)胞比例明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);轉(zhuǎn)染48h后，Eca109/miR-210組

9、G2/M期增多更為明顯(P＜0.01)。然而，Eca109/miR-210、Eca109/Control和Eca109/ncRNA三組轉(zhuǎn)染24、48h后細(xì)胞凋亡比例未見明顯變化。
　　結(jié)論:miR-210在乏氧食管Eca109細(xì)胞中高表達(dá)，miR-210過表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與G2/M期阻滯相關(guān)。
　　第二部分 miR-210靶向調(diào)控Plk1基因表達(dá)的研究
　　目的:篩選miR-210調(diào)控G2/M期轉(zhuǎn)換的可能靶

10、基因，并驗(yàn)證miR-210對(duì)預(yù)測(cè)靶基因的調(diào)控關(guān)系。
　　方法:應(yīng)用生物信息學(xué)手段對(duì)miR-210的可能靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，經(jīng)酶切及基因測(cè)序鑒定構(gòu)建含有預(yù)測(cè)靶基因3'-UTR報(bào)告載體pmiR-RB-REPORTTM，應(yīng)用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光活性的變化。WesternBlot檢測(cè)miR-210對(duì)預(yù)測(cè)靶基因蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，篩選Plk1作為miR-210調(diào)控G2/M期轉(zhuǎn)換的潛在靶基因。經(jīng)過酶切及

11、基因測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建含有Plk1基因3'-UTR熒光素酶報(bào)告載體pmiR-RB-REPORTTM-Plk1。與共轉(zhuǎn)染pmiR-RB-Report_PLK1+mimic sNC相比，HEK293T/17細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pmiR-RB-Report_PLK1+mimics210后熒光素酶活性顯著下(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染miR-210 mimics48h后，對(duì)Eca109細(xì)胞進(jìn)行Plk1蛋白的檢測(cè)，結(jié)果提示與Eca109/Control組及Eca

12、109/NC組比較，Eca109/miR-210組Plk1蛋白表達(dá)水平顯著下降(P＜0.01)。
　　結(jié)論:miR-210與靶基因Plk1 mRNA3'-UTR能夠有效結(jié)合，miR-210過表達(dá)抑制Plk1基因蛋白表達(dá)。Plk1是miR-210的直接靶基因。
　　第三部分放療對(duì)食管鱗癌患者血漿miR-210、miR-21表達(dá)水平的影響
　　目的:檢測(cè)食管癌患者血漿miR-210、miR-21表達(dá)水平，并評(píng)估根治性放療對(duì)

13、血漿miR-210、miR-21表達(dá)水平的影響。
　　方法:采集食管癌初治患者根治性放療前后及健康志愿者血液標(biāo)本，應(yīng)用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)血漿miR-210和miR-21的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:22例初治食管鱗癌患者及15例健康志愿者入組，共采集合格血液樣本59份。RT-PCR顯示，食管癌組血漿miR-210、miR-21的表達(dá)較健康對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)。血漿miR-210、miR-21表