奧沙利鉑聯(lián)合CD-Endostatin融合基因對直腸癌殺傷作用的研究.pdf

1、直腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈顯著上升趨勢。目前傳統(tǒng)的治療手段如放療、化療、手術等未能明顯提高直腸癌患者的5年生存率。因為化療、放療等在治療腫瘤的同時對正常組織亦存在損傷，使用劑量受到限制。且部分腫瘤出現(xiàn)對化療及放療的耐受也影響了其療效。隨著對結直腸癌基因研究的深入，直腸癌的各種基因治療正逐漸受到重視。目前最有臨床應用前景的基因治療方法包括自殺基因治療及抗血管生成基因治療等。 抗血管生成基因治療是指應用基因表達與

2、調控等手段抑制實體瘤的血管生長，切斷腫瘤的營養(yǎng)供給，對腫瘤采取饑餓療法，從而達到治療腫瘤的目的。在這方面的研究中，Endostatin(內(nèi)皮抑素)是最新發(fā)現(xiàn)的強有力的新生血管內(nèi)皮細胞生成的抑制劑，能夠抑制體內(nèi)多種實體瘤的生長，已顯示出廣闊的臨床應用前景。 自殺基因系統(tǒng)以其多方面的優(yōu)越性在腫瘤基因治療中倍受關注，它通過直接殺傷作用及“旁觀者效應”發(fā)揮抗腫瘤效應。大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(cytosine deaminase，CD)基因

3、是繼單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV2TK)后又一重要的自殺基因，與HSV2TK相比，CD基因具有更強的”“旁觀者效應”及存在遠距離“旁觀者效應”的特點，CD自殺基因治療(亦稱分子化療)腫瘤具有廣泛的應用前景，在美國被稱為最有前途的基因治療方案。 利用基因工程技術，將抗血管生成基因治療的Endostatin基因、CD自殺基因融合，協(xié)同作用于直腸癌。鑒于脂質體轉染基因具有安全性，不產(chǎn)生排異反應，可反復轉染等優(yōu)點，但不足是轉染效率不

4、如病毒載體高。如果將脂質體轉染基因治療和第三代鉑類化療藥物奧沙利鉑結合起來，既可以利用奧沙利鉑存在的對脂質體促進轉染作用，克服脂質體轉染效率低下的不足，使基因治療與化療有機的結合起來，無疑為惡性腫瘤的治療又增加了新的手段和方法。 目的：明確奧沙利鉑促進脂質體對直腸癌細胞的轉染效率，探討奧沙利鉑聯(lián)合CD-Endostatin對直腸癌細胞的協(xié)同殺傷作用。將奧沙利鉑聯(lián)合脂質體轉染CD-Endostatin基因對HR-8348直腸癌荷瘤

5、鼠治療，觀察其療效，從而為臨床治療直腸癌提供理論依據(jù)。 方法：一、構建含融合基因pcDNA-CD-sED質粒。二、脂質體法，體外轉染含有CD基因、CD-Endostatin基因的質粒于直腸癌細胞株HR-8348，用G418(400ug/L)繼續(xù)培養(yǎng)篩選轉染陽性細胞，同時用未轉染的HR-8348細胞做對照。觀察對照細胞大部分死亡時，更換G418(200ug/L)維持篩選。15天后觀察抗性克隆形成。獲得穩(wěn)定表達的克隆細胞，傳染至HR

6、-8348細胞后的陽性克隆子分別命名HR-8348CD(轉染pcDNA-CD質粒)，HR-8348ECD(轉染pcDNA-CD-sED質粒)，挑出陽性克隆，擴增培養(yǎng)。含綠色熒光蛋白(GFP)基因質粒轉染HR-8348細胞，用奧沙利鉑促轉染，用GFP基因表達綠色熒光蛋白觀察脂質體轉染效率及奧沙利鉑的促轉染作用。三、Western印跡檢測pcDNA-CD-sED轉染不同時間后細胞裂解液中Endostatin蛋白表達。用MTT法測定轉染CD-

7、Endostatin基因陽性克隆子表達Endostatin蛋白的上清液對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的抑制作用。四、MTT檢測奧沙利鉑聯(lián)合CD-Endostmin基因對HR-8348細胞殺傷作用。五、荷瘤裸鼠的制備及分組：將HR.8348細胞0.2ml(0.5×10<'7>細胞/ml)接種于4.5周BALB/C-nu/nu裸鼠右側后肢外側皮下，待瘤體長至長徑達0.5cm后，用隨機數(shù)字法將裸鼠分為4組：(1)奧沙利鉑聯(lián)合CD-Endostatin基因

8、組：通過尾靜脈注入低劑量的奧沙利鉑2.5mg-kg<'-1>，應用1ml注射器對每個腫瘤于奧沙利鉑作用后第0、4、8、12天多點注射(至少4個點)200ul Lipofectin-pcDNA-CD-sED復合體；第3天開始腹腔注射5*FC 500mg/kg/day，連續(xù)12天。(2)奧沙利鉑聯(lián)合CD基因組10只：通過尾靜脈注入低劑量的奧沙利鉑2.5mg.kg<'-1>，應用lml注射器對每個腫瘤于第0、4、8、12天多點注射200ul

9、Lipofectin-pcDNA-CD復合體；第3天開始腹腔注射5-FC 500mg/kg/day，連續(xù)12天。(3)奧沙利鉑組10只：通過尾靜脈注入低劑量的奧沙利鉑2.5mg.kg<'-1>，只注射生理鹽水，200ul生理鹽水于第0、4、8、12天行瘤體內(nèi)多點注射。(4)空白對照組：只注射生理鹽水，200ul生理鹽水于第0、4、8、12天行瘤體內(nèi)多點注射。于治療后28天拉頸法處死各組裸鼠。繪制荷瘤裸鼠的腫瘤生長曲線，計算瘤體積抑制率及

10、瘤重抑制率。免疫組化染色觀察腫瘤內(nèi)部的新生血管密度。六、統(tǒng)計學處理：均數(shù)應用x±s表示，應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件行x<'2>檢驗和方差分析，以P<0.05為統(tǒng)計學顯著差異。 結果：一、倒置熒光顯微鏡觀察GFP蛋白顯示：經(jīng)奧沙利鉑作用后，脂質體轉染細胞的轉染效率明顯增強(可提高18倍左右)，可利用奧沙利鉑促進脂質體轉染基因治療。二、Western印跡檢測pcDNACD-sED轉染不同時間后細胞裂解液中人Endostatin蛋白

11、顯示：感染細胞24h后表達人Endostatin蛋白，在120h達到高峰，并持續(xù)到180h，說明Endostatin基因在HR-8348細胞獲得高效及長時間的表達。CD-Endostatin基因陽性克隆子表達Endostatin蛋白的上清液對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的有明顯的抑制作用。三、體外試驗結果顯示：聯(lián)合CD基因及5-FC系統(tǒng)能夠明顯增強對HR-8348細胞的殺傷效率，用IC50濃度的奧沙利鉑作用，轉染CD基因的HR-8348細胞實驗組細

12、胞抑制率均值為86.2％，轉染CD-Endostatin基因組與單純轉染CD基因無明顯差異；未轉染CD基因的HR-8348細胞對照組細胞抑制率均值為48.1％，其差異有顯著性意義(p<0.05)。四、荷瘤小鼠腫瘤抑制率結果顯示：奧沙利鉑聯(lián)合CD-Endostatin基因組，奧沙利鉑聯(lián)合CD基因組，奧沙利鉑組腫瘤生長抑制率分別為79.69％、51.67％、37.67％，奧沙利鉑聯(lián)合CD-Endostmin基因組較奧沙利鉑治療組、奧沙利鉑聯(lián)

13、合CD基因組差異有顯著性(P<0.01)。五、癌組織病理學檢查結果：奧沙利鉑聯(lián)合CD-Endostmin基因組的腫瘤細胞數(shù)目較其它三組明顯減少，腫瘤細胞呈退行性病變，核分裂相明顯減少，不見瘤巨細胞，而腫瘤細胞被大量的脂肪細胞所代替。同時，奧沙利鉑聯(lián)合CD-Endostatcin基因組可明顯減少腫瘤內(nèi)部的新生血管密度，其他治療組較對照組減少腫瘤內(nèi)部的新生血管密度不明顯。 結論：1、化療藥物奧沙利鉑具有提高脂質體對直腸癌細胞HR-8

14、348轉染效率的作用，應用奧沙利鉑后的轉染效率能接近病毒載體轉染水平。2、Endostatin在體外試驗中能抑制內(nèi)皮細胞增生，小鼠荷瘤試驗證明了Endostatin通過抑制內(nèi)皮細胞增生來控制腫瘤新生血管的形成，從而達到阻止直腸癌生長及轉移。3、CD-Endostatin聯(lián)合基因治療，從腫瘤治療的兩個重要方向即腫瘤細胞內(nèi)靶向化療與抑制腫瘤新生血管形成，協(xié)同發(fā)揮CD基因、Endostatin基因對直腸癌的殺傷作用。4、利用脂質體反復轉染CD