奧沙利鉑聯(lián)合CD-Endostatin融合基因?qū)χ蹦c癌殺傷作用的研究.pdf

1、直腸癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)。目前傳統(tǒng)的治療手段如放療、化療、手術(shù)等未能明顯提高直腸癌患者的5年生存率。因?yàn)榛?、放療等在治療腫瘤的同時(shí)對(duì)正常組織亦存在損傷，使用劑量受到限制。且部分腫瘤出現(xiàn)對(duì)化療及放療的耐受也影響了其療效。隨著對(duì)結(jié)直腸癌基因研究的深入，直腸癌的各種基因治療正逐漸受到重視。目前最有臨床應(yīng)用前景的基因治療方法包括自殺基因治療及抗血管生成基因治療等。 抗血管生成基因治療是指應(yīng)用基因表達(dá)與

2、調(diào)控等手段抑制實(shí)體瘤的血管生長(zhǎng)，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供給，對(duì)腫瘤采取饑餓療法，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。在這方面的研究中，Endostatin(內(nèi)皮抑素)是最新發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)有力的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的抑制劑，能夠抑制體內(nèi)多種實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，已顯示出廣闊的臨床應(yīng)用前景。 自殺基因系統(tǒng)以其多方面的優(yōu)越性在腫瘤基因治療中倍受關(guān)注，它通過直接殺傷作用及“旁觀者效應(yīng)”發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(cytosine deaminase，CD)基因

3、是繼單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV2TK)后又一重要的自殺基因，與HSV2TK相比，CD基因具有更強(qiáng)的”“旁觀者效應(yīng)”及存在遠(yuǎn)距離“旁觀者效應(yīng)”的特點(diǎn)，CD自殺基因治療(亦稱分子化療)腫瘤具有廣泛的應(yīng)用前景，在美國(guó)被稱為最有前途的基因治療方案。 利用基因工程技術(shù)，將抗血管生成基因治療的Endostatin基因、CD自殺基因融合，協(xié)同作用于直腸癌。鑒于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染基因具有安全性，不產(chǎn)生排異反應(yīng)，可反復(fù)轉(zhuǎn)染等優(yōu)點(diǎn)，但不足是轉(zhuǎn)染效率不

4、如病毒載體高。如果將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染基因治療和第三代鉑類化療藥物奧沙利鉑結(jié)合起來，既可以利用奧沙利鉑存在的對(duì)脂質(zhì)體促進(jìn)轉(zhuǎn)染作用，克服脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率低下的不足，使基因治療與化療有機(jī)的結(jié)合起來，無疑為惡性腫瘤的治療又增加了新的手段和方法。 目的：明確奧沙利鉑促進(jìn)脂質(zhì)體對(duì)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，探討奧沙利鉑聯(lián)合CD-Endostatin對(duì)直腸癌細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用。將奧沙利鉑聯(lián)合脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CD-Endostatin基因?qū)R-8348直腸癌荷瘤

5、鼠治療，觀察其療效，從而為臨床治療直腸癌提供理論依據(jù)。 方法：一、構(gòu)建含融合基因pcDNA-CD-sED質(zhì)粒。二、脂質(zhì)體法，體外轉(zhuǎn)染含有CD基因、CD-Endostatin基因的質(zhì)粒于直腸癌細(xì)胞株HR-8348，用G418(400ug/L)繼續(xù)培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞，同時(shí)用未轉(zhuǎn)染的HR-8348細(xì)胞做對(duì)照。觀察對(duì)照細(xì)胞大部分死亡時(shí)，更換G418(200ug/L)維持篩選。15天后觀察抗性克隆形成。獲得穩(wěn)定表達(dá)的克隆細(xì)胞，傳染至HR

6、-8348細(xì)胞后的陽(yáng)性克隆子分別命名HR-8348CD(轉(zhuǎn)染pcDNA-CD質(zhì)粒)，HR-8348ECD(轉(zhuǎn)染pcDNA-CD-sED質(zhì)粒)，挑出陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)。含綠色熒光蛋白(GFP)基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HR-8348細(xì)胞，用奧沙利鉑促轉(zhuǎn)染，用GFP基因表達(dá)綠色熒光蛋白觀察脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率及奧沙利鉑的促轉(zhuǎn)染作用。三、Western印跡檢測(cè)pcDNA-CD-sED轉(zhuǎn)染不同時(shí)間后細(xì)胞裂解液中Endostatin蛋白表達(dá)。用MTT法測(cè)定轉(zhuǎn)染CD-

7、Endostatin基因陽(yáng)性克隆子表達(dá)Endostatin蛋白的上清液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用。四、MTT檢測(cè)奧沙利鉑聯(lián)合CD-Endostmin基因?qū)R-8348細(xì)胞殺傷作用。五、荷瘤裸鼠的制備及分組：將HR.8348細(xì)胞0.2ml(0.5×10<'7>細(xì)胞/ml)接種于4.5周BALB/C-nu/nu裸鼠右側(cè)后肢外側(cè)皮下，待瘤體長(zhǎng)至長(zhǎng)徑達(dá)0.5cm后，用隨機(jī)數(shù)字法將裸鼠分為4組：(1)奧沙利鉑聯(lián)合CD-Endostatin基因

8、組：通過尾靜脈注入低劑量的奧沙利鉑2.5mg-kg<'-1>，應(yīng)用1ml注射器對(duì)每個(gè)腫瘤于奧沙利鉑作用后第0、4、8、12天多點(diǎn)注射(至少4個(gè)點(diǎn))200ul Lipofectin-pcDNA-CD-sED復(fù)合體；第3天開始腹腔注射5*FC 500mg/kg/day，連續(xù)12天。(2)奧沙利鉑聯(lián)合CD基因組10只：通過尾靜脈注入低劑量的奧沙利鉑2.5mg.kg<'-1>，應(yīng)用lml注射器對(duì)每個(gè)腫瘤于第0、4、8、12天多點(diǎn)注射200ul

9、Lipofectin-pcDNA-CD復(fù)合體；第3天開始腹腔注射5-FC 500mg/kg/day，連續(xù)12天。(3)奧沙利鉑組10只：通過尾靜脈注入低劑量的奧沙利鉑2.5mg.kg<'-1>，只注射生理鹽水，200ul生理鹽水于第0、4、8、12天行瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射。(4)空白對(duì)照組：只注射生理鹽水，200ul生理鹽水于第0、4、8、12天行瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射。于治療后28天拉頸法處死各組裸鼠。繪制荷瘤裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線，計(jì)算瘤體積抑制率及

10、瘤重抑制率。免疫組化染色觀察腫瘤內(nèi)部的新生血管密度。六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：均數(shù)應(yīng)用x±s表示，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件行x<'2>檢驗(yàn)和方差分析，以P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。 結(jié)果：一、倒置熒光顯微鏡觀察GFP蛋白顯示：經(jīng)奧沙利鉑作用后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率明顯增強(qiáng)(可提高18倍左右)，可利用奧沙利鉑促進(jìn)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染基因治療。二、Western印跡檢測(cè)pcDNACD-sED轉(zhuǎn)染不同時(shí)間后細(xì)胞裂解液中人Endostatin蛋白

11、顯示：感染細(xì)胞24h后表達(dá)人Endostatin蛋白，在120h達(dá)到高峰，并持續(xù)到180h，說明Endostatin基因在HR-8348細(xì)胞獲得高效及長(zhǎng)時(shí)間的表達(dá)。CD-Endostatin基因陽(yáng)性克隆子表達(dá)Endostatin蛋白的上清液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的有明顯的抑制作用。三、體外試驗(yàn)結(jié)果顯示：聯(lián)合CD基因及5-FC系統(tǒng)能夠明顯增強(qiáng)對(duì)HR-8348細(xì)胞的殺傷效率，用IC50濃度的奧沙利鉑作用，轉(zhuǎn)染CD基因的HR-8348細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組細(xì)

12、胞抑制率均值為86.2％，轉(zhuǎn)染CD-Endostatin基因組與單純轉(zhuǎn)染CD基因無明顯差異；未轉(zhuǎn)染CD基因的HR-8348細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞抑制率均值為48.1％，其差異有顯著性意義(p<0.05)。四、荷瘤小鼠腫瘤抑制率結(jié)果顯示：奧沙利鉑聯(lián)合CD-Endostatin基因組，奧沙利鉑聯(lián)合CD基因組，奧沙利鉑組腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為79.69％、51.67％、37.67％，奧沙利鉑聯(lián)合CD-Endostmin基因組較奧沙利鉑治療組、奧沙利鉑聯(lián)

13、合CD基因組差異有顯著性(P<0.01)。五、癌組織病理學(xué)檢查結(jié)果：奧沙利鉑聯(lián)合CD-Endostmin基因組的腫瘤細(xì)胞數(shù)目較其它三組明顯減少，腫瘤細(xì)胞呈退行性病變，核分裂相明顯減少，不見瘤巨細(xì)胞，而腫瘤細(xì)胞被大量的脂肪細(xì)胞所代替。同時(shí)，奧沙利鉑聯(lián)合CD-Endostatcin基因組可明顯減少腫瘤內(nèi)部的新生血管密度，其他治療組較對(duì)照組減少腫瘤內(nèi)部的新生血管密度不明顯。 結(jié)論：1、化療藥物奧沙利鉑具有提高脂質(zhì)體對(duì)直腸癌細(xì)胞HR-8

14、348轉(zhuǎn)染效率的作用，應(yīng)用奧沙利鉑后的轉(zhuǎn)染效率能接近病毒載體轉(zhuǎn)染水平。2、Endostatin在體外試驗(yàn)中能抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生，小鼠荷瘤試驗(yàn)證明了Endostatin通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生來控制腫瘤新生血管的形成，從而達(dá)到阻止直腸癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。3、CD-Endostatin聯(lián)合基因治療，從腫瘤治療的兩個(gè)重要方向即腫瘤細(xì)胞內(nèi)靶向化療與抑制腫瘤新生血管形成，協(xié)同發(fā)揮CD基因、Endostatin基因?qū)χ蹦c癌的殺傷作用。4、利用脂質(zhì)體反復(fù)轉(zhuǎn)染CD