內(nèi)蒙古地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株分子分型研究.pdf

1、目的：
　　對內(nèi)蒙古自治區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行分子分型研究，了解該地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的基因型構(gòu)成、主要流行株及其相關(guān)傳播流行特征，進(jìn)而為該地區(qū)結(jié)核病防治提供一定的基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.于2011年1月至2012年6月收集內(nèi)蒙古自治區(qū)結(jié)核病防治所從臨床診斷為結(jié)核病的病人分離獲得的500株分枝桿菌臨床分離株及其背景資料和標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv（ATCC27294），均由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防

2、控制所結(jié)核病實驗室保藏并提供本研究使用。
　　2.采用L-J培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，收集菌體，提取全基因組DNA用于菌種鑒定和基因分型。
　　3.用多位點PCR鑒定菌種。
　　4.分別采用21 MIRU-VNTR位點的多位點串聯(lián)重復(fù)序列分析（MLVA）和間隔寡核苷酸分型（Spoligotyping）兩種基因分型方法對已鑒定為結(jié)核分枝桿菌的臨床分離株進(jìn)行基因分型研究，同時應(yīng)用BioNumerics5.0軟件對分型結(jié)果進(jìn)行聚類分析

3、，并將Spoligotyping分型結(jié)果與國際SpolD4.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，而其中的北京家族菌株的遺傳特征則應(yīng)用核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear transcription factors or neuronot，NTF）和大片段多態(tài)性（large sequence polymorphism，LSP）進(jìn)一步分析探討。
　　5.采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件、卡方檢驗（χ2 test）分析內(nèi)蒙古地區(qū)北京家族菌株與主要民族、性別、年齡、結(jié)

4、核病類型及病例類型間的關(guān)系，從而探討該地區(qū)北京家族菌株的流行傳播機(jī)制。P≤0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.共收集500株分枝桿菌分別分離于500例臨床診斷為結(jié)核病患者的痰標(biāo)本。經(jīng)多位點PCR鑒定，482株為結(jié)核分枝桿菌（MTB），用于進(jìn)一步基因分型研究；另外18株為非結(jié)核分枝桿菌（NTM）。
　　2.采用MLVA方法對482株結(jié)核分枝桿菌的21個VNTR位點進(jìn)行檢測，及BioNumerics軟件進(jìn)行聚類

5、，可分為349個VNTR基因型，其中279株菌表現(xiàn)為獨特基因型，203株表現(xiàn)為70簇，分別含有2或2株以上的菌株。成簇率為27.59％。
　　3.經(jīng)Spoligotyping分型，482株菌呈現(xiàn)出52個基因型，其中35株菌表現(xiàn)有獨特基因型，其余447株菌成簇分別為17個基因型。其北京家族菌株為主要流行株，所占比率達(dá)到86.72%（418/482）。
　　4. NTF分析北京家族菌株顯示，69.62%（291/418）菌株表現(xiàn)

6、為在NTF區(qū)存在1～2個IS6110的插入，稱之為“現(xiàn)代型”，剩下30.38%（127/418）菌株表現(xiàn)為NTF區(qū)完整，即屬于“古典型”。
　　5. LSP中RD105的分析結(jié)果與Spoligotyping分型結(jié)果一致，在RD105表現(xiàn)缺失的418株結(jié)核分枝桿菌，在Spoligotyping分型中的35到43間隔區(qū)存在3～9個雜交，即表現(xiàn)為北京家族。然而，RD181分析表現(xiàn)為6.46%（27/418）的菌株中RD181完整，93.

7、54%（391/418）的菌株中RD181缺失。這27株（21.26%，27/127）RD181完整的北京家族菌株在NTF都表現(xiàn)為“古典型”，但其余100株（78.74%，100/127）“古典型”北京家族菌株表現(xiàn)為RD181缺失。
　　6. MLVA和Spoligotyping的比較，MLVA分辨率明顯高于Spoligotyping，而Spoligotyping對北京家族的鑒定有利于MLVA進(jìn)一步對該家族進(jìn)行株水平的分析。

8、>　　7.內(nèi)蒙古地區(qū)北京家族菌株與主要民族、性別、年齡、結(jié)核類型及病例類型間的關(guān)系分析，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均為P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.內(nèi)蒙古地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株存在明顯的基因多態(tài)性，且北京家族為該地區(qū)的主要流行株。
　　2. RD105與Spoligotyping二者鑒定北京家族菌株的能力一致。北京家族菌株中“現(xiàn)代型”占主要，且RD181的分析顯示其缺失發(fā)生早于NTF區(qū)IS6110的插入。