北京地區(qū)結核分枝桿菌的基因分型及北京家族進化的初步研究.pdf

1、目的：對北京地區(qū)結核分枝桿菌進行基因分型以及進行北京家族進化的探討，了解北京地區(qū)結核分枝桿菌的菌株基因型特征、主要流行型及北京家族進化的特征，為追索傳染源、尋找傳播途徑和加強結核病的預防與控制提供基礎科學依據。
　　 方法：采用隨機整群抽樣方法選取北京市朝陽區(qū)為調查點，于2009年3月-2010年12月，收集從朝陽區(qū)結核防治所門診及住院結核病人分離到的臨床痰標本及其背景資料，用改良羅氏培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，通過生化反應方法進行菌種鑒定

2、。水煮法提取全基因組DNA，聚合酶鏈反應(PCR)擴增整個DR區(qū)，進行間隔區(qū)寡核苷酸分型(Spoligotyping)，同時進行15個VNTR位點多位點數目可變串聯重復序列分析(MLVA)分型，并對RD105、RD181和NTF位點進行大片段缺失分析(LSP);采用BioNumerics軟件5.0進行聚類分析，運用excel、SPSS、SAS軟件進行VNTR位點重復單位的多態(tài)性即Hunter-Gaston分辨指數(HGI)的計算，卡方檢

3、驗及多因素的logistic回歸分析。
　　 結果：總共分離到分枝桿菌360株，經生化反應方法鑒定，354株為結核分枝桿菌。
　　 1.間隔區(qū)寡核苷酸分型法(Spoligotyping):
　　 354株結核分枝桿菌被分為40種基因型(shared internationaltypes，STs)，包含12個簇和28種單一菌株類型。最大的一個簇含292株(82.5％)，為北京家族(1-9STs)，而非北京家族表現為

4、高度的多態(tài)性，可分為30種基因型，25種表現為單一菌株類型（獨特基因型），主要有T1和T2家族，分別包含31株(8.8％)和5株(1.4％);logistic逐步回歸分析結果顯示:結核病患者戶籍地在北方的北京家族結核菌株的比例是患者戶籍地在南方的4.624倍，95％CI為2.517～8.497。
　　 2.多位點數目可變串聯重復序列分析(MLVA)
　　 354株結核分枝桿菌被分為228種基因型，其中189種基因型為單一

5、菌株類型（獨特基因型），占53.4％，北京家族結核菌株被分為172種基因型，其中138(80.2％)種基因型為單一菌株類型;北京家族和非北京家族的成簇率分別為52.4％和20.3％。戶籍地為北京和南方患者結核分枝桿菌成簇率分別為50.6％和25.7％，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); logistic逐步回歸分析結果顯示結核病患者戶籍地在北京可以正向預測成簇率(OR=2.207，95％CI為1.201～4.057)，基因型為北京家族

6、可以正向預測成簇率（OR=4.240，95％CI為2.022～8.891）;15個VNTR位點對所有菌株和北京家族菌株的HGI值分別為0.978和0.967。每個VNTR位點對所有結核菌株以及北京家族有著各自不同的分辨能力。
　　 3.北京家族結核分枝桿菌進化的初步探索研究
　　 290株北京家族結核分枝桿菌中，古代型北京家族菌株占53.1％，現代型北京家族占46.2％;北京家族菌株主要表現為四個亞群，其中最大的一個亞群

7、占49.0％，表現為RD105和RD181缺失并且在NTF基因區(qū)域有IS6110插入（現代型）;RD105和Spoligotyping兩種方法鑒定北京家族一致性程度的Kappa值為0.77; ETRD、MIRU26、Mtub21和Mtub30四個位點可以提供北京家族系統(tǒng)進化的信號。
　　 結論：
　　 1.北京地區(qū)結核分枝桿菌存在明顯的基因多態(tài)性，主要流行菌株為北京家族;北京家族菌株的流行與結核病患者所在戶籍地相關，結核

8、病近期傳播與戶籍地相關。
　　 2.北京地區(qū)北京家族結核分枝桿菌中，古代型和現代型的比例相當，前者較高于后者;北京家族結核分枝桿菌主要表現為四個亞群，最大的一個亞群基因型特征表現為RD105和RD181缺失并且為現代型，這個分枝有可能是主導北京家族進化過程的一個重要分枝。
　　 3.RD105作為鑒定北京家族菌株非常有價值的分子標志，但其不能完全替代金標準Spoligotyping進行北京家族菌株的鑒定，使用時應慎重。<