結核分枝桿菌北京家族菌株的起源、進化及其與現(xiàn)代人類遷移的聯(lián)系.pdf

1、我國是全球22個結核高負擔國家之一，結核病人數(shù)位居世界第二。我國的結核疫情主要由結核分枝桿菌北京家族菌株(簡稱北京菌株)所致。該菌株在東亞各國高度流行，并在全球廣泛傳播。在表型上，北京菌株通常被認為具有更強的致病性和耐藥性，但不同實驗或地區(qū)的結果并不一致；在基因型上，北京菌株被認為是一個遺傳相似度極高的群體，但近期大量分型或測序數(shù)據(jù)提示該群體內部存在一定的遺傳差異性。目前為止，北京菌株的遺傳結構仍缺乏系統(tǒng)的研究；北京菌株的起源問題也存在

2、爭議。了解北京菌株的起源、進化和傳播歷史對進一步認識其在全球的廣泛分布及其致病性和耐藥性有重要意義。
　　 通過對從全球范圍內收集的58株北京菌株的22個3R基因進行測序分析，我們首先建立了北京菌株高分辨率的系統(tǒng)發(fā)生樹；根據(jù)該系統(tǒng)樹，北京菌株可被進一步分為多個相互間具有一定遺傳距離的亞型。隨后通過對305株北京菌株進行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型，我們進一步研究了全球北京菌株的群體結構。分型結果提示，全球范圍流行的北京菌株主要由

3、一個近期進化出的Bmyc10亞型所致。
　　 為了進一步探索北京菌株的起源、進化及其與人類遷移的聯(lián)系，我們對全國范圍內11個省市收集的北京菌株進行了SNP分型。同時我們從上海市收集的北京菌株中挑選了各亞型的代表菌株(共計39株)進行全基因組測序。聯(lián)合已發(fā)表的22個結核全基因組測序數(shù)據(jù)，我們構建了全基因組系統(tǒng)發(fā)生樹；同時，通過貝葉斯進化分析我們推算了北京及其亞型菌株的起源年代。根據(jù)該系統(tǒng)發(fā)生樹，我們發(fā)現(xiàn)前期在東南亞地區(qū)分離的“前北

4、京”菌株代表了北京菌株祖先最早分化的一個分枝；而對全國范圍內的菌株分型結果表明“前北京”菌株非常稀少且僅存在于我國南方地區(qū)(廣西、福建、浙江和四川)。時間推算結果顯示北京菌株的起源年代為距今2-3萬年左右，該時間和東亞人口在東南亞起源的年代完全相符。綜上我們推斷北京菌株很可能起源于東南亞和我國南方交界的地區(qū)。
　　 北京家族各亞型菌株在11個省市的分布表明，早期分化的“古老”型菌株在全國廣泛存在，且在西藏和日韓等地為主要流行菌株

5、。聯(lián)合東亞早期人口遷移路線，我們推測北京菌株在東南亞一帶起源后，隨著人群從南向北的遷移傳播到我國大部分地區(qū)并到達日韓等地。“現(xiàn)代”型菌株是我國除西藏外其他地區(qū)的主要流行菌株，其在漢族人群中的比例顯著高于在少數(shù)名族人群中的比例。而漢族人群中，北方人群中的比例顯著高于南方。因此我們推測“現(xiàn)代”型菌株可能起源于北方漢族的祖先人群中。全基因組系統(tǒng)發(fā)生樹顯示“現(xiàn)代”型菌株在距今約6000年前發(fā)生了一次大規(guī)模的擴張，這與“新石器”時期農業(yè)產生后仰韶

6、社會人群(北方漢族祖先)擴張的年代完全相符，從而進一步證明了“現(xiàn)代”菌株很可能起源于我國北方。北方漢族人群在近2000多年的時間在東亞發(fā)生了大規(guī)模擴張和遷移，我們推測“現(xiàn)代”型菌株在我國及東亞各地區(qū)廣泛的分布很可能與漢族人群的遷移相關。在漢族人口較少的西藏和日韓等地，“現(xiàn)代”型菌株比例甚至低于“古老”型，從而進一步證明了這一假設。
　　 “現(xiàn)代”型北京菌株在早期北方人群中的擴張及后來在東亞及世界各地廣泛流行都提示該亞型菌株很可能

7、具有較強的致病性。我們相信通過更深入的比較基因組學研究很可能找出該亞型菌株菌株成為優(yōu)勢菌株的遺傳學機制。另外，“現(xiàn)代”菌株在我國的高度流行提示結防部門需加大病例發(fā)現(xiàn)和早期診斷的力度，從而降低該菌株在人群中的傳播和進一步擴張。
　　 “現(xiàn)代”型北京菌株在我國龐大群體數(shù)量及菌株間高度的遺傳相似性使得研究該菌株的近期傳播比較困難。目前歐美推行的15和24位點可變串聯(lián)重復序列(VNTR)分型方法在運用于我國流行的北京菌株群體時往往存在簇

8、病例間無流行病學聯(lián)系的情況。通過對上海市崇明地區(qū)以人群為基礎收集的191株北京菌株進行15位點VNTR和8位點SNP分型，我們發(fā)現(xiàn)5個15位點定義的簇菌株包含了兩個或多個北京亞型的菌株。通過聯(lián)合VNTR和SNP構建系統(tǒng)樹，我們證明以上現(xiàn)象一方面是由于15位點VNTR對“現(xiàn)代”型菌株分辨力偏低所致；另一方面，“現(xiàn)代”型菌株間通過趨同或平行進化形成的VNTR基因型非同源相似性也會導致錯誤的定義簇菌株。所以，我們推薦聯(lián)合SNP和VNTR分型在

9、“現(xiàn)代”型北京菌株高度流行的地區(qū)進行分子流行病學研究。但目前為止，仍缺乏統(tǒng)一的VNTR分型方案用于我國結核分子流行病學研究。標準的15和24位點VNTR因其位點數(shù)較多且很多位點分辨力較低而不太適用于我國結核分型。通過對篩選的24個位點在全國范圍6個地區(qū)以人群為基礎收集的1375株菌株中進行分辨力及各種VNTR組合的HGI值進行研究，我們挑選了廣泛適用的10個VNTR位點(MIRU10，26，31，40；QUB11b，18，26；Mtub

10、04，21及ETR-A)作為研究我國結核分子流行病學的一線分型方案。這10個位點聯(lián)合3個高變位點及QUB11a作為二線分型方案，可準確的定義不同地區(qū)菌株的近期傳播。
　　 全基因組比對的結果表明，北京各亞型菌株間存在一定的遺傳學差異。我們推測這些差異會導致不同亞型菌株間對抗生素適應性的異同。通過對上海市疾控中心2004-2008年收集的242個耐多藥菌株進行SNP分型及一線藥物耐藥突變分析，我們發(fā)現(xiàn)高度流行的“現(xiàn)代”型北京菌株在

11、rpoB531位點的突變頻率較其在其它亞型菌株高(OR=1.8，P=0.04)；而在幾個低度流行的“古老”亞型菌株中，利福平耐藥突變主要分布在rpoB531和rpoB526位點以外(OR=3.16，P<0.01)。rpoB531和ropB526位點的突變由于對細菌適應力的損傷較低，被認為是導致利福平耐藥的優(yōu)勢突變?！艾F(xiàn)代”型菌株可能具有更強的致病性使其在病人體內具有更高的菌載量，從而更易篩選出攜帶優(yōu)勢突變的耐藥菌株。根據(jù)這242個耐多藥

12、菌株的突變特征，我們篩選出了11個位點用于預測一線藥物耐藥表型。該11位點可預測93.8％利福平耐藥，89.3％異煙肼耐藥及86.8％耐多藥表型?；谶@些突變位點，我們進一步研發(fā)了一種基于實時熒光PCR探針溶解曲線分析的新技術用于耐藥結核的快速診斷。由于該方法只用了一種熒光標記的探針，所以成本較低且可廣泛適用于各種熒光PCR檢測平臺。
　　 綜上，本論文通過研究結核北京菌株的起源和進化進一步揭示了結核的傳播與現(xiàn)代人類遷移、擴張之