結(jié)核分枝桿菌北京家族菌株的起源、進(jìn)化及其與現(xiàn)代人類遷移的聯(lián)系.pdf

1、我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病人數(shù)位居世界第二。我國(guó)的結(jié)核疫情主要由結(jié)核分枝桿菌北京家族菌株(簡(jiǎn)稱北京菌株)所致。該菌株在東亞各國(guó)高度流行，并在全球廣泛傳播。在表型上，北京菌株通常被認(rèn)為具有更強(qiáng)的致病性和耐藥性，但不同實(shí)驗(yàn)或地區(qū)的結(jié)果并不一致；在基因型上，北京菌株被認(rèn)為是一個(gè)遺傳相似度極高的群體，但近期大量分型或測(cè)序數(shù)據(jù)提示該群體內(nèi)部存在一定的遺傳差異性。目前為止，北京菌株的遺傳結(jié)構(gòu)仍缺乏系統(tǒng)的研究；北京菌株的起源問題也存在

2、爭(zhēng)議。了解北京菌株的起源、進(jìn)化和傳播歷史對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)其在全球的廣泛分布及其致病性和耐藥性有重要意義。
　　 通過對(duì)從全球范圍內(nèi)收集的58株北京菌株的22個(gè)3R基因進(jìn)行測(cè)序分析，我們首先建立了北京菌株高分辨率的系統(tǒng)發(fā)生樹；根據(jù)該系統(tǒng)樹，北京菌株可被進(jìn)一步分為多個(gè)相互間具有一定遺傳距離的亞型。隨后通過對(duì)305株北京菌株進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型，我們進(jìn)一步研究了全球北京菌株的群體結(jié)構(gòu)。分型結(jié)果提示，全球范圍流行的北京菌株主要由

3、一個(gè)近期進(jìn)化出的Bmyc10亞型所致。
　　 為了進(jìn)一步探索北京菌株的起源、進(jìn)化及其與人類遷移的聯(lián)系，我們對(duì)全國(guó)范圍內(nèi)11個(gè)省市收集的北京菌株進(jìn)行了SNP分型。同時(shí)我們從上海市收集的北京菌株中挑選了各亞型的代表菌株(共計(jì)39株)進(jìn)行全基因組測(cè)序。聯(lián)合已發(fā)表的22個(gè)結(jié)核全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，我們構(gòu)建了全基因組系統(tǒng)發(fā)生樹；同時(shí)，通過貝葉斯進(jìn)化分析我們推算了北京及其亞型菌株的起源年代。根據(jù)該系統(tǒng)發(fā)生樹，我們發(fā)現(xiàn)前期在東南亞地區(qū)分離的“前北

4、京”菌株代表了北京菌株祖先最早分化的一個(gè)分枝；而對(duì)全國(guó)范圍內(nèi)的菌株分型結(jié)果表明“前北京”菌株非常稀少且僅存在于我國(guó)南方地區(qū)(廣西、福建、浙江和四川)。時(shí)間推算結(jié)果顯示北京菌株的起源年代為距今2-3萬年左右，該時(shí)間和東亞人口在東南亞起源的年代完全相符。綜上我們推斷北京菌株很可能起源于東南亞和我國(guó)南方交界的地區(qū)。
　　 北京家族各亞型菌株在11個(gè)省市的分布表明，早期分化的“古老”型菌株在全國(guó)廣泛存在，且在西藏和日韓等地為主要流行菌株

5、。聯(lián)合東亞早期人口遷移路線，我們推測(cè)北京菌株在東南亞一帶起源后，隨著人群從南向北的遷移傳播到我國(guó)大部分地區(qū)并到達(dá)日韓等地?！艾F(xiàn)代”型菌株是我國(guó)除西藏外其他地區(qū)的主要流行菌株，其在漢族人群中的比例顯著高于在少數(shù)名族人群中的比例。而漢族人群中，北方人群中的比例顯著高于南方。因此我們推測(cè)“現(xiàn)代”型菌株可能起源于北方漢族的祖先人群中。全基因組系統(tǒng)發(fā)生樹顯示“現(xiàn)代”型菌株在距今約6000年前發(fā)生了一次大規(guī)模的擴(kuò)張，這與“新石器”時(shí)期農(nóng)業(yè)產(chǎn)生后仰韶

6、社會(huì)人群(北方漢族祖先)擴(kuò)張的年代完全相符，從而進(jìn)一步證明了“現(xiàn)代”菌株很可能起源于我國(guó)北方。北方漢族人群在近2000多年的時(shí)間在東亞發(fā)生了大規(guī)模擴(kuò)張和遷移，我們推測(cè)“現(xiàn)代”型菌株在我國(guó)及東亞各地區(qū)廣泛的分布很可能與漢族人群的遷移相關(guān)。在漢族人口較少的西藏和日韓等地，“現(xiàn)代”型菌株比例甚至低于“古老”型，從而進(jìn)一步證明了這一假設(shè)。
　　 “現(xiàn)代”型北京菌株在早期北方人群中的擴(kuò)張及后來在東亞及世界各地廣泛流行都提示該亞型菌株很可能

7、具有較強(qiáng)的致病性。我們相信通過更深入的比較基因組學(xué)研究很可能找出該亞型菌株菌株成為優(yōu)勢(shì)菌株的遺傳學(xué)機(jī)制。另外，“現(xiàn)代”菌株在我國(guó)的高度流行提示結(jié)防部門需加大病例發(fā)現(xiàn)和早期診斷的力度，從而降低該菌株在人群中的傳播和進(jìn)一步擴(kuò)張。
　　 “現(xiàn)代”型北京菌株在我國(guó)龐大群體數(shù)量及菌株間高度的遺傳相似性使得研究該菌株的近期傳播比較困難。目前歐美推行的15和24位點(diǎn)可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)分型方法在運(yùn)用于我國(guó)流行的北京菌株群體時(shí)往往存在簇

8、病例間無流行病學(xué)聯(lián)系的情況。通過對(duì)上海市崇明地區(qū)以人群為基礎(chǔ)收集的191株北京菌株進(jìn)行15位點(diǎn)VNTR和8位點(diǎn)SNP分型，我們發(fā)現(xiàn)5個(gè)15位點(diǎn)定義的簇菌株包含了兩個(gè)或多個(gè)北京亞型的菌株。通過聯(lián)合VNTR和SNP構(gòu)建系統(tǒng)樹，我們證明以上現(xiàn)象一方面是由于15位點(diǎn)VNTR對(duì)“現(xiàn)代”型菌株分辨力偏低所致；另一方面，“現(xiàn)代”型菌株間通過趨同或平行進(jìn)化形成的VNTR基因型非同源相似性也會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的定義簇菌株。所以，我們推薦聯(lián)合SNP和VNTR分型在

9、“現(xiàn)代”型北京菌株高度流行的地區(qū)進(jìn)行分子流行病學(xué)研究。但目前為止，仍缺乏統(tǒng)一的VNTR分型方案用于我國(guó)結(jié)核分子流行病學(xué)研究。標(biāo)準(zhǔn)的15和24位點(diǎn)VNTR因其位點(diǎn)數(shù)較多且很多位點(diǎn)分辨力較低而不太適用于我國(guó)結(jié)核分型。通過對(duì)篩選的24個(gè)位點(diǎn)在全國(guó)范圍6個(gè)地區(qū)以人群為基礎(chǔ)收集的1375株菌株中進(jìn)行分辨力及各種VNTR組合的HGI值進(jìn)行研究，我們挑選了廣泛適用的10個(gè)VNTR位點(diǎn)(MIRU10，26，31，40；QUB11b，18，26；Mtub

10、04，21及ETR-A)作為研究我國(guó)結(jié)核分子流行病學(xué)的一線分型方案。這10個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合3個(gè)高變位點(diǎn)及QUB11a作為二線分型方案，可準(zhǔn)確的定義不同地區(qū)菌株的近期傳播。
　　 全基因組比對(duì)的結(jié)果表明，北京各亞型菌株間存在一定的遺傳學(xué)差異。我們推測(cè)這些差異會(huì)導(dǎo)致不同亞型菌株間對(duì)抗生素適應(yīng)性的異同。通過對(duì)上海市疾控中心2004-2008年收集的242個(gè)耐多藥菌株進(jìn)行SNP分型及一線藥物耐藥突變分析，我們發(fā)現(xiàn)高度流行的“現(xiàn)代”型北京菌株在

11、rpoB531位點(diǎn)的突變頻率較其在其它亞型菌株高(OR=1.8，P=0.04)；而在幾個(gè)低度流行的“古老”亞型菌株中，利福平耐藥突變主要分布在rpoB531和rpoB526位點(diǎn)以外(OR=3.16，P<0.01)。rpoB531和ropB526位點(diǎn)的突變由于對(duì)細(xì)菌適應(yīng)力的損傷較低，被認(rèn)為是導(dǎo)致利福平耐藥的優(yōu)勢(shì)突變?！艾F(xiàn)代”型菌株可能具有更強(qiáng)的致病性使其在病人體內(nèi)具有更高的菌載量，從而更易篩選出攜帶優(yōu)勢(shì)突變的耐藥菌株。根據(jù)這242個(gè)耐多藥

12、菌株的突變特征，我們篩選出了11個(gè)位點(diǎn)用于預(yù)測(cè)一線藥物耐藥表型。該11位點(diǎn)可預(yù)測(cè)93.8％利福平耐藥，89.3％異煙肼耐藥及86.8％耐多藥表型?；谶@些突變位點(diǎn)，我們進(jìn)一步研發(fā)了一種基于實(shí)時(shí)熒光PCR探針溶解曲線分析的新技術(shù)用于耐藥結(jié)核的快速診斷。由于該方法只用了一種熒光標(biāo)記的探針，所以成本較低且可廣泛適用于各種熒光PCR檢測(cè)平臺(tái)。
　　 綜上，本論文通過研究結(jié)核北京菌株的起源和進(jìn)化進(jìn)一步揭示了結(jié)核的傳播與現(xiàn)代人類遷移、擴(kuò)張之