NM23對(duì)PDGF-A啟動(dòng)子成分的切割、轉(zhuǎn)錄抑制及含nm23重組腺病毒的構(gòu)建.pdf

1、該文利用5,SHS的C豐富鏈(py)篩選Hela細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫(kù)發(fā)現(xiàn)三個(gè)cDNA克隆,均編碼NM23-H1——一個(gè)在乳房癌和黑素瘤中具抑制腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的蛋白.為研究NM23抑制轉(zhuǎn)錄及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的可能作用機(jī)制,進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn):1.重組人NM23蛋白的表達(dá)、純化用含有nm23-H1或nm23-H2基因的pET3C質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組人NM23-H1和NM23-H2蛋白,經(jīng)硫酸鉸分級(jí)分離、純化柱(DE

2、AE-Sephacel,HTP)純化,得到純度高于95﹪的蛋白.2.重組人NM23蛋白對(duì)5'SHS、NHE成分的切割及其轉(zhuǎn)錄抑制活性分析用EMSA方法分析了重組人NM23-H1和NM23-H2對(duì)5'SHS、NHE的DMA結(jié)合及切割活性,測(cè)定了切割位點(diǎn),分析了切割模式.3.含人nm23基因的重組腺病毒的構(gòu)建與擴(kuò)增純化應(yīng)用PCR和DNA重組技術(shù),將nm23 cDNA克隆到pCRⅡ 擴(kuò)增載體中并測(cè)序,再將目的片段亞克隆到真核表達(dá)載體pCI中,

3、用BglⅢ、ClaI將目的片段(包括CMV強(qiáng)啟動(dòng)子、內(nèi)含子、nm23基因、IRES、hgfp基因、SV40 polyA)切下,連接入腺病毒穿棱載體pAdLink中,然后用NheI線性化nm23/pAdLink質(zhì)粒,將其與ClaI線性化的野生型腺病毒dl327共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,通過(guò)在熒光顯微鏡下觀察發(fā)出綠色熒光的情況及Southern blot方法鑒定、篩選出發(fā)生了正確重組的含有nm23基因的重組腺病毒.大規(guī)模擴(kuò)增重組腺病毒并用Vira-